胡 晟 邹 浩 周 磊 邱岚茜 张小文

胆管恶性肿瘤(biliary tract cancers, BTCs)预后较差，其特点是早期侵犯淋巴结和全身转移[1]。这类疾病包括胆囊癌(gallbladder cancer, GBC)和胆管癌(cholangiocarcinoma, CCA)，分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)和肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma, eCCA)。目前，手术切除仍是治疗BTCs的主要方法，辅助性放化疗并不是这些恶性肿瘤的首选。此外，在行根治性手术后许多患者仍会复发，复发或转移性BTCs患者的预后通常较差。因此，有必要对BTCs潜在生物学标志物进行进一步的研究，以便对BTCs行早期诊断、进行综合性治疗及判断患者预后。最近的研究已经将微RNA(microRNA，miRNA)描述为某些恶性肿瘤的潜在生物学标志物。然而，miRNA的表达及其如何对BTCs的诊断、预后和治疗产生影响的机制尚未清楚。虽然miRNA是一种非编码小RNA(19～23个核苷酸)，但其在调控大量重要的生物学功能方面发挥了重要作用，研究miRNA有利于BTCs的诊断、预后和治疗。miRNA通过与mRNA3′非编码区(3′UTRs)的结合调控并表达特异的靶基因，这些表达对于不同类型的恶性肿瘤的疾病发展起着至关重要的作用，包括肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭。

一、miRNA的调控机制及其靶向基因

目前有关miRNA生物起源和成熟的研究模型表明，该过程首先在细胞核中进行，然后在细胞质中进行[2]。miRNA的生物起源的最关键一步是miRNA的前体pri-miRNA的形成,通常由RNA聚合酶Ⅱ转录生成，其长度一般为几千个核苷酸[3]。尽管如此，pri-miRNA通常包含4个尿嘧啶，其转录过程将被转录酶Ⅲ终止。由核糖核酸酶Ⅲ催化，促使pre-miRNA分裂，形成了由70个核苷酸左右组成的前体miRNA(pre-miRNA)。由于双链RNA结合域(dsRBD)和狄乔治氏相关蛋白8抗体(DGCR8)蛋白的作用，所以pri-miRNA转化为pre-miRNA的过程是高效的。随后，pre-miRNA通过结合一个称为输出蛋白5的核出口因子，将前miRNA运输到细胞质中，并在Dicer酶的催化下形成成熟的双链miRNA[4]。该成熟miRNA的功能链主要参与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)的形成，它通过降解相应的mRNA或抑制编码蛋白的合成，对靶基因的表达产生负性作用。通过miRNA和mRNA的靶向基因3UTR近乎完美的碱基互补，转录后的基因可以保持沉默[5]。

尽管miRNA的生物起源已越来越确定，但其潜在的调控机制仍然不太清楚[6]。大量的研究证据表明，miRNA表达的调控机制包括转录解控、表观遗传学改变、突变、DNA复制异常以及miRNA在其生物起源中存在的缺陷，这些机制可能与人类癌症中miRNA的解控机制密切相关[7]。此外，研究的重点是miRNA表达的表观遗传学改变和甲基化和组蛋白修饰对miRNA的表达，这两者都是表观遗传基因调控的标志[8]。例如,在胆管癌(cholangiocarcinoma, CCA)细胞中，miR-370作为一种抑癌基因可抑制原癌基因的致敏蛋白激酶8 (MAP3K8)[9]。此外，白介素-6 (IL-6)过表达CCA通过DNA超甲基化降低miR-370表达，同时恢复MAP3K8表达，这有助于肿瘤细胞生长，促进CCA的进展。另一项研究表明，miR-370的免疫球蛋白-二甲基甲酰胺(IG-DMR)表达反应了IL-6在人类CCA诱导的高甲基化调控[10]。

据报道，几种转录因子通过与miRNA的调控区域结合，促进miRNA的转录进而促进miRNA的表达。例如，螺旋-环-螺旋型亮氨酸的转录因子(c-Myc)的表达增加，可以直接结合miR-17的调控区域来促进miRNA的表达[11]。miRNA的上调可能是由于扩增、转录因子的失调和CpG岛在人类癌症特异性miRNA基因启动子区域的脱甲基作用。此外，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)普遍存在于miRNA基因中，可以调节miRNA的数量使其具有多种功能，这可能与肿瘤的发生和发展有密切关系[12]。

miRNA可以作为肿瘤致癌基因或抑癌基因，这在很大程度上取决于其靶基因的作用。一个miRNA可以调节许多不同的靶mRNA，相反地，几个不同的miRNA可以对一个目标mRNA进行联合调控。因此，miRNA及其靶向基因将形成复杂的调控网络。在癌症中上调的miRNA可作为肿瘤致癌基因，通过抑制抑癌基因的表达和抑制参与细胞增殖或凋亡的基因来促进癌症的发生，而下调的miRNA可作为肿瘤抑癌基因从而抑制癌症的发生。最近，越来越多的研究者对癌症潜在的基因变异进行了深入研究，例如癌基因和抑癌基因在人类BTCs发病机制中的作用[13]。

二、miRNA在胆管恶性肿瘤中的作用及临床意义

根据目标mRNA的作用，大量解控的miRNA被归类为原癌基因miRNA和抑癌基因miRNA。在BTCs中，研究较为透彻的miRNA是hsa-miR-21，它通常被认为是一种原癌基因miRNA，因为它的过表达与肿瘤细胞的侵袭和转移有关[14]。Liu等[15]观察到hsa-miR-21在过表达后可显著促进肿瘤细胞迁移、侵袭并能够将其转化为CCA细胞系(QBC939和RBE)。此外，在hsa-miR-21过表达后可表现出E-cadherin表达减少、N-cadherin和波形蛋白表达增加。因此，hsa-miR-21可诱导CCA的上皮细胞间质化(EMT)。在这一过程中，上皮细胞失去了细胞极性和细胞黏附功能，这可能是由于E-cadherin表达的减少，使得细胞可以迁移和侵袭周围组织；E-cadherin表达减少或缺失在肿瘤的侵袭和转移过程中起着关键的作用。

相似的，miRNA的异常表达同样能诱导EMT并增强GBC细胞的迁移能力。Bao等[16]报道hsa-miR-101过表达可抑制GBC细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导E-cadherin和β-catenin的表达增加，并导致波形蛋白表达减少。此外，研究者发现hsa-miR-101的下调与肿瘤直径、侵袭、淋巴结转移、TNM分期以及GBC患者的生存率低有关。这些结果表明，hsa-miR-101在GBC中发挥了抑癌基因作用，减弱了EMT和细胞转移。

越来越多的研究表明hsa-miR-146b-5p具有重要的抑癌作用[17]。与邻近的非肿瘤组织相比，GBC组织的hsa-miR-146b-5p基因表达明显下调。此外，SGC-996 GBC细胞系中hsa-miR-146b-5p的过表达可抑制细胞的生长、加速细胞凋亡、抑制G1期细胞生长。然而，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)作为一种结合表皮生长因子(可诱导细胞增殖)的细胞表皮蛋白，其过量表达可逆转hsa-miR-146b-5p抑制细胞增殖的能力。此外，hsa-miR-146b-5p的表达水平与肿瘤的直径和肿瘤的进展有显著的相关性[18]。

最近的研究已经将hsa-miR-135a-5p描述为具有抑癌作用的一类基因[19]。在GBC中，Zhou等[20]发现，与邻近的非肿瘤胆囊组织相比，hsa-miR-135a-5p在肿瘤组织中的表达明显下调，特别是在Ⅲ级和Ⅳ级肿瘤中。hsa-miR-135a-5p抑制GBC细胞在G1/S期的增殖和复制能力，这些研究提示hsa-miR-135a-5p可能抑制GBC细胞的增殖。

三、miRNAs作为胆管恶性肿瘤的生物学标志物

在CCA患者血清中miRNA-106a表达明显降低，与良性胆管疾病(benign biliary tract disease，BBD)和健康人群相比差异明显，miRNA-106a下调与肿瘤淋巴结转移和患者预后不佳密切相关。值得注意的是，miRNA-106a的血清表达水平逐渐下降，在健康个体中表达最高，在BBD患者中表达中等，在CCA患者中表达最低。

Meng等[21]描述了一种可作为胆管癌生物学标志物的miRNA，他们发现miR-21和miR-200b与吉西他滨的敏感度或耐药性有关。目前已有各种文献报道了循环miRNA在BTCs中诊断和预后潜在的临床价值，大多数miRNA在CCA中表达，而在GBC和壶腹腺癌中表达较少。Li等[22]分析了GBC患者循环miRNA的表达，发现miR-21、miR-187和miR-202上调;相比之下，在GBC患者和健康对照组(P<0.05)之间，miR-143和miR-335下调(P<0.05)，在组织和血液样本中出现一致的表达。此外, 3种miRNA(miR-187、miR-143、miR-202)和淋巴转移的差异表达之间存在显著的关系，miR-21的过表达更与TNM分期的进程密切相关，这意味着临床医师可以联合利用CA19-9和miR-21来鉴别诊断BTCs和健康人群。术后循环miR-21表达下降。此外，miR-21在人的CCA组织和细胞系中均呈过度表达，其敏感度和特异性分别为95%和100%，足以区分CCA与正常组织[23]。

Plieskatt等[24]对iCCA肿瘤组织中的miRNA表达水平进行了综合分析，发现8个miRNA(miR-483-5p、miR-505-3p、miR-874、miR-885-5p、miR-320b、miR-92b-3p、miR-1275和miR-1307-3p)的表达仅在iCCA患者血浆样本中检测出，而未在对照组血浆中检测出。此外，肿瘤组织中异常的miRNA表达与在血浆中观察到的不相符，其中有15个高度管制的miRNA仅在肿瘤组织样本中检测到。故血浆中的这个表达谱可以作为早期诊断iCCA的生物学标志物。Wang等[25]研究了miRNA在肿瘤组织和对照血浆样本中的表达，发现miR-150表达显著，在ICC血浆患者中上调，在肿瘤组织中观察到在组织中下调的相反结果。miR-150表达水平与患者年龄、性别和肿瘤分期比较，差异无统计学意义。

Huang等发现miR-224在血清中明显上调，与健康对照组相比CCA患者肿瘤组织中miR-224也有明显地上调。此外，以miR-224干预人类CCA细胞系可增强细胞生长、侵袭性和迁移能力。Kojima等研究了大量的BTCs和胃肠道肿瘤病例，他们发现，66个miRNA在测试队列中比较差异有统计学意义，其中30个miRNA被上调，36个miRNA在BTCs中下调。在BTCs和健康组的比较中，miR-125a-3p和miR-6893-5p的表达表现出最小的P值。同时，Que等对壶腹癌(ampullary carcinoma,AC)中部分循环miRNA的表达进行了评价，选取了与胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PA)相关的4个miRNA(miR-17-5p、miR-21、miR-155和miR-196a)，以评价血清体外miRNA水平。PA患者与AC患者的miR-21和miR-17-5p的表达水平比较，差异无统计学意义，此外这些miRNA在AC中的表达往往高于健康对照组。根据这些结果，所选的miRNA对胰腺癌和BTCs比较，差异均无统计学意义。

Cheng等的另一项研究发现，与BBD患者或健康对照组相比，CCA患者的循环miR-106a下调。此外，CCA患者血清miR-21表达水平高于BBD对照组。利用血清miR-106a的曲线面积(area under the curve,AUC)从健康对照组区分CCA患者为0.89;该标记的敏感度和特异性分别为81.6%和85.0%。这一结果的敏感度和特异性比血清CA19-9要高。与此同时，血清样本中miR-106a的下调与CCA患者的淋巴结转移和预后不佳有关。

四、展 望

miRNA具有巨大的科学和临床意义，目前越来越清楚地认识到这种非编码RNA是导致恶性肿瘤的一个主要因素。miRNA不仅提示了作为BTCs新的治疗靶点，并且利于我们更多地了解导致BTCs细胞癌变的病理过程。miRNA通过直接转录抑制已知的肿瘤抑制基因，直接促进肿瘤细胞的增殖和侵袭性，是一种强有力的致癌基因。miRNA不仅能在细胞增殖、分化和凋亡等方面发挥重要的作用，而且还能作为癌基因、肿瘤抑制物、新生物学标志物在诊断和预后中发挥作用，以及在BTCs中作为化疗耐药的增强剂。此外，miR-21、miR-187、miR-143和miR-202的表达与肿瘤进展和淋巴转移之间存在显著的关系。综上所述，这些研究反映出miRNA可作为临床应用的潜在生物学标志物，用于BTCs的早期诊断及判断其预后。因此利用miRNA作为早期诊断性生物学标志物可能是改善BTCs患者预后的一个有效手段。然而，迄今为止很少有研究明确指出在miRNA在BTCs患者中的意义。故目前仍需要更多研究数据来确定哪些miRNA可作为BTCs的潜在治疗靶点或诊断和预后生物学标志物，所以进一步研究循环miRNA在BTCs患者中的意义仍是以后科研及临床的迫切需求。