孙明明　周文杰　纪红昌　黄建斌　赵方贵　唐艳艳　朱虹　姜德锋　乔利仙

摘要：利用沙土培養法，使用1、3、5、7、10 mg·L-1乙烯利溶液处理花生品种花育22种子，5 d后测量下胚轴长度。结果表明：经乙烯利处理后，花生下胚轴生长受到显著抑制而增粗变短，受抑制程度随乙烯利溶液浓度的提高而增加，3 mg·L-1乙烯利处理的下胚轴长度极显著低于未施加和施加1 mg·L-1乙烯利处理的，因此选用3 mg·L-1乙烯利对诱变筛选得到的165 份花生种质进行种子萌发处理，有145 份种质表现为下胚轴生长受抑制而增粗变短，属于正常的乙烯敏感型种质;有11 份种质下胚轴生长并未受到明显抑制，显著高于同样条件处理下花育22的下胚轴长度，属于乙烯不敏感型种质;有9 份种质下胚轴生长受到显著抑制，其下胚轴长度极显著低于同样条件处理下花育22的下胚轴长度，属于乙烯超敏感型种质。使用50 μmol·L-1 ACC（1-氨基环丙烷羧酸）溶液对筛选获得的11 份不敏感种质进行验证处理，其中，9 份种质保持了对乙烯不敏感的特点，下胚轴生长仍未受到明显抑制。通过在沙土中添加0.7% NaCl溶液，继续对筛选得到的9份乙烯不敏感型种质进行耐盐筛选，有1份种质表现为下胚轴生长受抑制程度最低，下胚轴长度显著高于同样处理条件下花育22的下胚轴长度，初步确定其为耐盐乙烯不敏感种质。因此，用3 mg·L-1乙烯利溶液预选、50 μmol·L-1 ACC溶液验证、0.7% NaCl溶液处理，通过评价黑暗条件下沙土培养的花生种子下胚轴长度，可以有效筛选到花生耐盐乙烯不敏感突变体。

关键词：花生;乙烯利;ACC（1-氨基环丙烷羧酸）;不敏感突变体;耐盐

中图分类号：S565.203.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）09-0132-07

Screening of Peanut Mutants with Salt Tolerance and Ethylene Insensitivity

Sun Mingming2， Zhou WenjieJi HongchangHuang JianbinZhao Fanggui2，

Tang Yanyan Zhu HongJiang DefengQiao Lixian1

（1.College of Agronomy， Qingdao Agricultural University/Shandong Peanut Industry Cooperative Innovation Center/Shandong

Key Laboratory of Dry-Land Farming Technology， Qingdao 266109， China; 2. College of Life Sciences， Qingdao Agricultural

University/Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province， Qingdao 266109， China）

Abstract Seeds of peanut cultivar Huayu 22 were cultured in sands with 3， 5， 7 and 10 mg·L-1 ethephon solution， and the hypocotyl length was measured after five days. The results showed that the hypocotyl growth was significantly inhibited and got shorter and weaker after treated with ethephon， and the inhibition increased with the increasing concentration of ethephon solution. Hypocotyl length treated with 3 mg·L-1 ethephon was significantly shorter than that treated with 1 mg·L-1 ethephon or not，So one hundred and sixty-five peanut germplasm accessions from mutagenesis were treated and screened with 3 mg·L-1 ethephon solution. The obvious hypocotyl growth inhibition was found in 145 accessions which belonged to the ethylene sensitive accessions. The hypocotyl growth of 11 accessions were not inhibited obviously， and were significantly higher than that of Huayu 22 under the same treatment， which belonged to the ethylene insensitive accessions. The significantly obvious hypocotyl growth inhibition was found in 9 accessions with the hypocotyl length significantly lower than that of Huayu 22 under the same treatment， which belonged to the ethylene super sensitive accessions. The seeds of selfed progenies from 11 insensitive accessions were cultured in sands with 50 μmol·L-1 ACC solution， and there were 9 accessions whose hypocotyl growth was still not inhibited obviously. Salt tolerance screening was conducted by adding 0.7% NaCl solution in sands for the 9 stable insensitive accessions. There was one accession whose hypocotyl growth was obviously higher than that of Huayu 22 under the same treatment， which was regarded as a salt tolerant and ethylene insensitive accession. Therefore， the salt tolerant and ethylene insensitive mutants of peanut could be screened by pre-selection with 3 mg·L-1 ethephon solution， validation with 50 μmol·L-1 ACC solution，treating with 0.7% NaCl solution and evaluating the hypocotyl length of peanut seeds cultured in sandy soil under dark conditions.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）; Ethephon; ACC （1-aminocyclopropanecarboxylic acid）; Insensitive mutant; Salt tolerance

花生（Arachis hypogaea L.）是重要的油料作物和经济作物[1]。由于盲目施用化肥、不合理轮作、灌溉面积扩大等原因，中国土壤次生盐渍化现象日趋严重[2，3]。土壤盐渍化已成为限制全世界农业生产的重要因素之一[4]，提高农作物对盐胁迫的抗性是农业生产中减轻盐胁迫不良影响的有效措施，其中筛选耐盐种质资源并加以利用是最有效的途径[5]。

乙烯是重要的植物激素之一，不仅调节植物生长发育，而且在植物逆境胁迫应答中发挥重要作用。乙烯对植物生长具有抑制茎伸长、促进茎或根增粗以及使茎横向生长三方面效应，称为植物对乙烯响应的“三重反应”。在拟南芥中，乙烯组成型突变体在无乙烯存在的条件下亦表现“三重反应”，而乙烯不敏感突变体在乙烯存在时不表现“三重反应”[6]。盐胁迫是影响植物生长最主要的逆境因素之一，乙烯作為一种逆境胁迫响应激素在植物抗盐过程中起着重要作用。一定水平的乙烯合成速率有利于增强植物体的盐胁迫抗性，例如，乙烯合成前体ACC处理可以显著增加野生型拟南芥幼苗在高盐环境下的抗盐能力和成活率[7]。据报道乙烯突变体与植物的耐盐性相关，如在拟南芥中功能获得型突变体etr1-1在种子萌发和幼苗阶段都表现出对盐的敏感性，相反功能缺失突变体etr1-7则表现出抗盐的特征[8-10]。CTR 1是受体下游另一个负调控因子，CTR1 的突变体表现出明显的高盐抗性表型，在200 mmol·L-1 NaCl 处理下，ctr1-1的幼苗成活率达到了90%[7]。乙烯应答因子（ethylene-response factors， ERF）也同样参与了植物的盐胁迫应答，如ERF类转录因子RAP2.6过表达转基因拟南芥在种子萌发及营养生长阶段能显著提高植物的抗渗透胁迫能力及耐盐性等[11]。

花生属于中度耐盐作物，开展花生耐盐性研究，培育耐盐花生品种，对提高盐碱地区花生产量、增加油脂供给具有重要意义。本项目组在前期研究中利用平阳霉素离体诱变结合组织培养及NaCl定向筛选获得一批花生突变体，部分突变体耐盐性显著提高，其自交后代在山东东营盐碱地表现出耐盐高产的特点，目前正在参加区域比较试验，近年有望推出高产耐盐新品种[12-14];且基于转录组测序差异基因表达分析表明，突变体与对照相比乙烯相关基因表达量存在明显差异[15]。本研究即以获得的花生突变体的自交后代为试材，利用乙烯利、ACC和NaCl溶液分别处理沙土培养的花生种子，以下胚轴长度作为评价耐盐性强弱的指标，建立了一套花生乙烯突变体的筛选方法，并对这些突变材料进行筛选，获得耐盐乙烯不敏感突变体，为在花生中进一步阐述乙烯与耐盐性的相关性提供研究材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花生栽培品种花育22（HY22，对照），本项目组前期经平阳霉素诱变处理筛选后所获得的突变体自交后代种质165 份，由青岛农业大学花生研究中心保存。

1.2 沙培法确定乙烯利筛选浓度

将沙子用自来水清洗干净，置入灭菌锅内高温灭菌（121℃，15 min）后晾干。取1 000 mL的大烧杯若干，每个烧杯中加沙子至700 mL刻度处，备用。设置乙烯利浓度梯度1、3、5、7、10 mg·L- 分别向烧杯中加入各浓度梯度的乙烯利溶液250 mL。每个烧杯种植10 粒花育22种子，顶面覆盖沙子至1 000 mL刻度，用保鲜膜封口，置25℃培养室中暗培养5 d后，将烧杯上层沙子倒掉，取出萌发的花生种子，测量下胚轴长度。试验设3次重复。

1.3 花生乙烯突变体的筛选

使用3 mg·L-1乙烯利溶液对165份花生种质进行处理，处理方法同1.2。对照花育22同时设置水处理及乙烯利处理两组。重复3次。处理结束后测量每粒种子的下胚轴长度。

1.4 花生乙烯突变体的ACC处理验证

使用1、10、50 μmol·L-1浓度梯度的ACC溶液对花育22种子进行萌发处理，根据试验结果选定50 μmol·L-1 ACC作为筛选验证浓度。用50 μmol·L-1 ACC溶液对乙烯利溶液筛选获得的11份种质的自交后代种子进行萌发处理，处理方法同1.2，设3次重复。对照花育22同时设水处理及ACC处理两组。

1.5 花生乙烯不敏感突变体的耐盐性验证

使用0.1%、0.5%、0.7%浓度梯度的NaCl溶液对花育22种子进行萌发处理，根据试验结果选定0.7% NaCl作为筛选浓度。用0.7%的NaCl溶液对筛选获得的9份乙烯不敏感种质的自交后代种子进行萌发处理，处理方法同1.2，设3次重复。对照花育22同时设水处理及NaCl处理两组。

1.6 数据处理与统计分析

试验数据采用SPSS 21.0进行多重比较和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 乙烯利筛选浓度的确定

沙培法暗培养5 d后取出萌发的花生种子（图1）。结果（图2、图3）显示不同浓度乙烯利溶液处理均会极显著抑制花生下胚轴的伸长，且随着乙烯利浓度的升高抑制作用增强。未经乙烯利溶液处理的种子下胚轴长度平均为6.24 cm，1 mg·L-1乙烯利溶液处理的下胚轴长度为3.06cm，两者差异达极显著水平（P<0.01）;3、5、7、10 mg·L-1乙烯利溶液处理的下胚轴长度分别为1.26、1.16、1.12、0.99 cm，四者间无显著差异，但均极显著低于1 mg·L-1乙烯利溶液处理。为了有效提高筛选效果，最终确定3 mg·L-1作为突变体筛选所用的乙烯利浓度。

2.2 花生乙烯突变体的筛选

165份突变种质经3 mg·L-1乙烯利处理后，有145 份种质表现为下胚轴生长受抑制而增粗变短，属于正常的乙烯敏感型种质;有11份种质（29#、5#、4#、9#等）下胚轴生长并未受到显著抑制，极显著高于同样条件处理下花育22的下胚轴长度，属于乙烯不敏感型种质;有9 份种质（8#、10#等）下胚轴生长受到显著抑制，其下胚轴长度极显著低于同样条件处理下花育22的下胚轴长度，属于乙烯超敏感型种质（图4、图5）。

2.3 ACC筛选浓度的确定

沙培法暗培养5 d后取出萌发的花生种子。结果（图6、图7）显示，不同浓度ACC溶液处理均会抑制花生胚轴的伸长，且随着ACC浓度的升高抑制作用增强。未经ACC溶液处理的种子下胚轴长度平均为6.2 cm，10 μmol·L-1 ACC溶液处理的下胚轴长度为4.1 cm，两者差异达到极显著水平（P<0.01）。50 μmol·L-1 ACC溶液处理的下胚轴长度为2.3 cm，极显著低于10 μmol·L-1 ACC溶液处理。为了尽可能地减少选择误差，最终确定50 μmol·L-1作为突变体筛选时的ACC浓度。

2.4 花生乙烯突变体的ACC处理验证

用50 μmol·L-1 ACC溶液对经乙烯利筛选得到的11份对乙烯不敏感型种质自交后代进行处理，其中9份种质下胚轴生长并未受到明显抑制，下胚轴长度显著（P<0.05）高于同样条件处理下的花育22，可以认定这9份种质为花生乙烯不敏感突变体种质（图8、图9）。

2.5 NaCl筛选浓度的确定

沙培法暗培养5 d后取出花生种子。结果（图10、图11）显示，不同浓度NaCl处理均会抑制花生胚轴的伸长，且随着NaCl浓度的升高抑制作用增强。未经NaCl溶液处理的种子下胚轴长度平均为6.2 cm，0.5% NaCl处理后下胚轴长度为3.8 cm，两者差异达到极显著水平（P<0.01）;0.7% NaCl处理的下胚轴平均长度为2.2 cm，极显著低于0.5% NaCl处理的下胚轴长度。为了尽可能地减少选择误差，最终确定0.7%作为突变体筛选时的NaCl浓度。

2.6 花生乙烯不敏感突变体的耐盐性验证

对ACC筛选得到的9 份对乙烯不敏感型种质进行0.7% NaCl溶液处理，其中1 份种质下胚轴长度极显著高于相同处理条件下对照花育22的下胚轴长度（P<0.01）（图12、图13），初步认定该种质为花生乙烯不敏感耐盐突变体种质，命名为M29。

3 讨论与结论

在拟南芥及烟草中通常利用在培养基中添加一定浓度的ACC溶液进行乙烯突变体的筛选，由于两者种子较小，在普通培养皿上即可完成筛选过程。而花生种子较大，受空间限制难以在培养皿中完成筛选试验。花生子叶肥厚、营养丰富，萌发过程只需添加水即可完成，培养基并非必需，加之普通固体培养基透气性较差，且常规培养瓶体积较小，无法满足花生在黑暗条件下胚轴的充分伸长，因此本研究采用沙培法在1 000 mL烧杯中进行花生萌发试验，操作简单且效果好。由于1 000 mL烧杯处理需要使用较多体积的处理液，本研究嘗试使用乙烯利替代ACC进行筛选，然后用ACC进行验证，结果表明使用乙烯利进行筛选完全可行，且大大降低了筛选成本，适用于大范围进行乙烯突变体的初步筛选工作。

经乙烯利筛选获得的11 份乙烯不敏感种质中，有9 份种质后代仍然保持了乙烯不敏感的特点，属于不再分离的纯合体;9 份乙烯超敏感突变体中，仅有1 份种质后代仍然保持了乙烯超敏感的特点，属于不再分离的纯合体，另外8份后代均发生分离，属于乙烯超敏感杂合体。关于这些乙烯不敏感与乙烯超敏感突变是属于同一等位基因突变还是非等位基因突变，仍需进一步的遗传分析鉴定。9份乙烯不敏感种质中仅有1 份种质后代表现为对NaCl处理的最小生长抑制程度，初步确定其为耐盐乙烯不敏感种质，后期将通过遗传杂交及后代分离比例进行进一步的遗传分析，确认相关基因，并进行相关基因的定位及功能验证，最终揭示乙烯参与花生耐盐性的分子机制。

参 考 文 献：

[1]万书波. 我国花生产业面临的机遇与科技发展战略[J].中国农业科技导报， 2009， 11（1）： 7-12.

[2]于延文，黄荣峰. 乙烯与植物抗逆性[J].中国农业科技导报，2013， 15（2）： 70-75.

[3]关元秀， 刘高焕， 刘庆生， 等. 黄河三角洲盐碱地遥感调查研究[J].遥感学报， 2005（1）： 46-52.

[4]Munns R， Tester M. Mechanisms of salinity tolerance[J].Annual Review of Plant Biology， 2008， 59： 651-681.

[5]黄易， 张玉龙. 保护地生产条件下的土壤退化问题及其防治对策[J].土壤通报， 2004，35（2）： 212-216.

[6]Wang F F， Cui X K， Sun Y， et al. Ethylene signaling and regulation in plant growth and stress responses[J].Plant Cell Reports， 2013， 32（7）： 1098-1099.

[7]Achard P， Cheng H， De Grauwe L， et al. Integration of plant responses to environmentally activated phytohormonal signals[J].Science， 2006， 311（5757）： 91-94.

[8]Cao W H， Liu J， Zhou Q Y， et al. Expression of tobacco ethylene receptor NTHK1 alters plant responses to salt stress[J].Plant Cell & Environment， 2006， 29： 1210-1219.

[9]Zhao X C， Schaller G E. Effect of salt and osmotic stress upon expression of the ethylene receptor ETR1 in Arabidopsis thaliana[J].FEBS Letters，2004， 562： 189-192.

[10] Cao W H， Liu J， He X J， et al. Modulation of ethylene responses affects plant salt-stress responses[J].Plant Physiology， 2007， 143： 707-719.

[11] Zhu Q， Zhang J T， Gao X S， et al. The Arabidopsis AP2/ERF transcription factor RAP2.6 participates in ABA， salt and osmotic stress responses[J].Gene， 2010， 457： 1-12.

[12] Zhao M X， Sun H Y， Ji R R， et al. In vitro mutagenesis and directed screening for salt-tolerant mutants in peanut[J].Euphytica， 2013， 189： 161-172.

[13] 喬利仙， 隋炯明， 赵丽兰， 等. 平阳霉素离体诱变花生M2代农艺性状分析[J].核农学报， 2014， 28（6）： 955-960.

[14] 王亚， 乔利仙， 武秀玲， 等. 平阳霉素诱变与NaCl定向筛选对花生后代产量和品质性状的影响[J].华北农学报， 2015， 30（1）： 202-206.

[15] Sui J M， Jiang P P， Qin G L， et al. Transcriptome profiling and digital gene expression analysis of genes associated with salinity resistance in peanut[J].Electronic Journal of Biotechnology， 2018， 32： 19-25.

收稿日期：2019-08-27

基金项目：山东省重点研发计划项目（2018GNC111014）;农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室开放课题基金项目（KF2018008）

作者简介：孙明明（1987—），男，山东海阳人，硕士研究生，主要从事遗传学方向研究。E-mail：932454855@qq.com

通讯作者：乔利仙（1973—），女，山西太谷人，博士，教授，主要从事花生生物技术育种研究。E-mail： lxqiao73@163.com