利用AhMITE转座子标记鉴定花生F1代真伪杂种

2019-12-09宁龙龙刘佳佳赵昆昆李柯李忠峰马兴立张幸果殷冬梅

山东农业科学 2019年9期

关键词：花生

宁龙龙　刘佳佳　赵昆昆　李柯　李忠峰　马兴立　张幸果　殷冬梅

摘要：本试验以花生品系花7616为父本、H1338为母本杂交得到的F1代群体为材料，利用AhMITE标记对F1代真伪杂种进行鉴定。结果表明：F1代群体78个单株中有8株呈现母本单一条带，50株呈现父本单一条带，20株是双亲杂合带型;结合父母本叶片表型特征，共有20个单株鉴定为真杂种，真杂种率为25.64%，与分子标记鉴定结果一致。综上，利用转座子分子标记可以准确地对杂交后代进行鉴定，进而为高世代RIL群体的构建奠定基础。

关键词：花生;杂种鉴定;转座子标记

中图分类号：S565.203.53文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）09-0063-05

Identification of Peanut F1 Authentic Hybrids by

AhMITE Transposon Markers

Ning Longlong， Liu Jiajia， Zhao Kunkun， Li Ke， Li Zhongfeng， Ma Xingli， Zhang Xingguo， Yin Dongmei

（College of Agronomy， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract This experiment used peanut line H1338 as female parent and Hua 7616 as male parent to identify the true and false F1 hybrids by AhMITE markers. The results showed that 8 of the 78 individual plants in F1 population showed a single band of female parent， fifty showed a single band of male parent， and 20 showed heterozygous bands of parents. Combined with the phenotypic characteristics of parents leaves， a total of 20 individual plants were identified as true hybrids， and the rate of true hybrids was 25.64%， which was consistent with the results of molecular marker identification. In conclusion， transposon molecular markers could accurately identify hybrid offspring， which laid foundations for the construction of high-generation RIL populations.

Keywords Peanut; Hybrid identification; Transposon marker

花生是重要的油料作物之一，不僅含油量高、营养价值丰富，还可以培肥土力、生物固氮。杂交育种是花生主要的育种方法，可通过基因重组综合双亲优良性状，基因累加产生超亲性状，基因互作产生新性状，使育种工作更具有目的性和创造性。

花生杂交F1代真假杂种鉴定常用传统鉴定法和分子鉴定法。传统鉴定法的优点是简便、直观，但存在鉴定时间长、易受环境条件影响、可用形态标记数量有限等缺点。随着分子生物技术的迅速发展，各种分子鉴定法不断创新。分子标记是传统遗传标记的发展，利用分子标记技术可使许多以前无法进行的研究得以实现。常见的分子标记有4类，第1类为基于DNA杂交的分子标记，主要有限制性片段长度多态性（RFLP）标记、可变数目串联重复序列（VNTR）标记;第2类为基于聚合酶链式反应的分子标记，包括随机扩增多态性DNA（RAPD）标记、简单序列重复（SSR）标记、序列特征性扩增区域（SCAR）标记、序列标签位点（STS）等;第3类为PCR与限制性酶切技术相结合的分子标记，主要有扩增片段长度多态性（AFLP）、酶切扩增多态性序列（CAPS）;第4类为基于基因组测序技术开发的分子标记，主要有单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失标记（In-Del）。目前，分子标记应用于构建遗传连锁图谱、基因定位、种质资源的鉴定及分类和辅助选择育种等多个方面。

转座子标记是一种以PCR技术为基础的分子标记[1]。转座子又称为可移动因子，是指一段特定的DNA序列，可在染色体组内移动，从一个位点切除插入到一个新的位点。微型反向重复转座元件（miniature inverted repeat transposable elements）简称MITE元件，是近年来在植物、细菌和动物基因组中发现的一种非自主转座的可转座DNA元件。它的结构组织和DNA转座子具有相似的地方，两端含有倒置重复序列（terminal inverted repeats，TIR），所处位点处具有正向重复（tandem short duplication，TSD）;不同之处在于位于TIR之间的DNA序列不编码转座所需的转座酶，也不一定编码功能性的基因产物。

AhMITE（微型倒转重复转座子）标记即AhTE标记，具有稳定、重复性好、多态性高、操作简单、耗时短等优点。Patel等[2]报道花生MITE的插入导致ahFAD2B功能异常而产生高油酸花生突变体。王洁等[3]用MITE对花生不同杂交组合的F1代进行鉴定。Gowda、俞朝、温小杰等[4-6]认为采用AhMITE标记鉴定的花生扩增产物片段差异大，利用琼脂糖凝胶电泳就可区分真假杂种，很大程度上提高了育种效率。为了对杂交后代进行真伪杂种鉴定，从而为高世代RIL群体构建奠定基础，本研究选择叶片表型性状与AhMITE分子标记相结合的方法，对花生品系花7616（父本）、H1338（母本）的F1代杂种进行真伪鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用花生品系花7616（父本）、H1338（母本）杂交得到的F1群体为材料。亲本均为河南农业大学花生课题组选育的纯合自交系。

1.2 花生叶片DNA的提取

取新鲜叶片0.1 g 装入2.0 mL的离心管中，置于液氮中速冻并充分研磨后加入800 μL的SLS提取液（pH=8.0），颠倒混匀20 min;加入等体积现配的酚+氯仿+异戊醇（25∶[KG-*2/3]24∶[KG-*2/3]1），颠倒混匀20 min;12 000 r/min离心10 min，吸取上清液至1.5 mL离心管中，加入等体积预冷异丙醇混匀，-20℃静置1 h;12 000 r/min离心5 min，倒掉上清液，用75%乙醇漂洗2～3次，95%乙醇漂洗1次，晾干后加入适量ddH2O溶解，并对得到的DNA进行相关质量检测。

1.3 花生亲本AhMITE标记的筛选

选取9对AhMITE引物（表1）对亲本进行多态性分析，选出能够使双亲扩增产物存在显著差异且条带清晰稳定的引物进行F1代杂种鉴定。

1.4 花生杂交F1代群体鉴定

利用筛选出的引物对F1群体进行PCR扩增，同时扩增双亲，通过比较鉴别F1代真伪杂种。PCR反应体系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix为10 μL ，模板DNA为1 μL，上、下游引物各1 μL，加入ddH2O至总体积达20 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min;95℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸30 s，30个循环;72℃延伸7 min，待循环完成后4℃保存。PCR扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用凝胶成像系统观察、拍照保存。

2 结果与分析

2.1 F1代群體DNA提取

经分光光度计检测可得，提取的DNA OD260/280均为1.8～2.0，OD260/230均为2.0左右，说明DNA提取质量较好，可进行后续试验。对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，待测样品均能跑出明亮单一条带。

2.2 AhMITE多态性标记引物的筛选

由图2可知，本试验设计的9对引物均可扩增出条带。其中，引物AhTE0015、AhTE0016、AhTE0018各扩增出2条带型，不同亲本中2条带型均相同;引物AhTE0029、AhTE0078、AhTE0394、AhTE0389、AhTE0254、AhTE0191均在双亲中扩增出1条带型，经分析发现，仅有引物AhTE0389扩增的双亲带型存在显著差异，母本带型分子量为600 bp，父本带型为300 bp。因此，本研究选用引物AhTE0389作为标记专用引物。

2.3 F1代群体真假杂种鉴定

2.3.1 F1代群体表型鉴定由图3可以看出，不同亲本的叶形存在差异：母本H1338的叶片较小，顶端向内凹陷呈扇形，叶缘从基部到顶端基本呈直线;父本花7616叶片相对较大呈椭圆形，叶片从基部到顶端呈现一定弧度。因此，杂交F1代的表型应介于两者之间，即叶片既向内凹陷，叶缘又有一定弧度。图3中，F1-3叶型与母本完全一致，为假杂种， F1-4叶型与父本完全一致，为假杂种，F1-1、 F1-2、 F1-5、 F1-6表型介于父母本之间，鉴定为真杂种。根据叶片表型鉴定结果，F1代群体78个单株中有8株与母本叶型完全一致，50株与父本叶型完全一致，20株叶型介于两者之间。

2.3.2 转座子标记鉴定利用筛选出的引物AHTE0389对78个F1代进行扩增，若F1扩增的条带同时含有父母本的带型则为真杂种，若只有母本的一条带型则为假杂种。扩增结果如图4所示，编号为1、11、26、29、31、42、53、60的只有母本1条带型，为假杂种，50个只具有父本的1条带型，为假杂种;20个具有父母本的杂合带型，为真杂种。

3 讨论与结论

花生真伪杂种的鉴定是构建花生遗传群体的中心一环，而花生遗传群体的构建则是选育新品种的基础，因此鉴定花生真假杂种十分必要。形态标记法是一种传统的鉴定方法[7]，通过鉴定F1代表型可分辨真假杂种，但实际操作过程中往往受到多种因素的限制：用于鉴定的形态学标记数量有限，而且有的标记在一定生育期才能表现出来;标记性状受环境影响较大，有些标记性状与不良性状发生连锁，难以进行鉴定;通过形态学标记鉴定的杂种第2年要再次种植才能确定鉴定结果是否正确。因此，该方法存在效率较低并且费时的弊端。分子标记直接在DNA水平上反映不同个体间差异[8]，可以在F1代直接鉴别真假杂种，用于鉴定的标记几乎遍布整个基因组，检测座位近乎无限，并且自然界存在许多等位变异，无需人工创造突变[9]。此外，分子标记鉴定的多态性高，不受环境条件影响，在植物的任何生育期尤其是早期即可进行真假杂种鉴定[10]。

花生真假杂种鉴定通常采用简单重复序列标记（SSR）[1 12]，鉴定效果较好，但需要经过垂直板聚丙酰胺凝胶电泳比较扩增条带的迁移距离，并且聚丙酰胺凝胶制胶和跑胶过程较为复杂。此外，利用特异SNP位点鉴定花生F1代真假杂种的结果准确性较高，但对DNA质量要求相对较高[13]。RAPD是一种常用的分子标记方法，一次扩增可产生许多条带，但重复性及稳定性较差。转座子标记是一种基于PCR的分子标记，其在基因组中的插入或者缺失可引起不同个体间的差异。本试验用SLS法提取花生DNA ，操作过程简便、提取效率高、质量好，可以同时进行大批量DNA提取，同时，采用的转座子标记方法经过琼脂糖凝胶电泳就可以比较扩增条带的迁移距离，重复性及稳定性好，操作步骤简单容易掌握。此外，本试验选择的性状在苗期就可表现出来，因此可提前进行杂交后代的筛选，提高了筛选效率;采用表型性状与分子标记相互结合、互相验证的方法，可以提高杂种鉴定的效率和构建高世代RIL群体的准确性。

目前，传统育种技术与分子标记的结合在花生的抗病育种、亲缘关系的研究等方面做出巨大贡献[14，15]。但由于遗传基础比较狭窄、分子标记的多态性较低，花生分子标记技术研究明显滞后于其它作物[16]。就目前来看，应用最多的是微卫星分子标记，但这类标记的技术操作比较复杂[17]。转座子标记的出现为花生育种开辟了新途径，相信随着研究的深入和发展，转座子将会在花生品种选育和性状遗传改良等方面发挥重要作用[18]。

参考文献：

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