李柯　赵昆昆　宁龙龙　马倩　李忠峰　马兴立　张幸果　殷冬梅

摘要：ω-6脂肪酸脱氢酶控制花生中油酸向亚油酸的转化，该酶由AhFAD2基因编码。为了研究AhFAD2基因的功能，本研究根据前期已经克隆得到的AhFAD2基因序列，设计了gRNA前导序列，并构建了CRISPR/Cas9基因编辑载体，通过双酶切和Sanger测序确定载体构建成功。AhFAD2基因CRISPR/Cas9载体的构建为接下来的遗传转化及研究该基因的功能奠定了基础。

关键词：花生;FAD2;CRISPR/Cas9;基因敲除

中图分类号：S565.2：Q782文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）09-0056-08

Construction of CRISPR/Cas9 Multi-Target

Knockout Vector of FAD2 Gene in Peanut

Li Ke， Zhao Kunkun， Ning Longlong， Ma Qian， Li Zhongfeng， Ma Xingli， Zhang Xingguo， Yin Dongmei

（College of Agronomy， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract The omega-6 fatty acid dehydrogenase controls the conversion of oleic acid into linoleic acid in peanut， which is encoded by the AhFAD2 gene. In order to research the function of AhFAD2 gene， the gRNA leader sequence was designed based on the sequence of AhFAD2 gene cloned in previous stage， and the CRISPR/Cas9 gene editing vector was constructed in this study. The vector was successfully constructed after determined by double enzyme digestion and Sanger sequencing. The construction of AhFAD2 gene CRISPR/Cas9 vector laid foundations for the subsequent genetic transformation and function study of the gene.

Keywords Peanut; FAD2; CRISPR/Cas9; Gene knockout

基因编辑技术是利用DNA断裂及其修复机制[1]，使其产生碱基的突变、DNA片段的缺失和插入等现象，达到使基因不能正常行使功能或改变其功能的目的。DNA双链断裂（DNA double-strand breaks， DSBs）的现象在分裂活跃的哺乳动物细胞中每天都会发生[2-5]，但这种自发断裂难以利用。因此，基因组定点编辑技术对基因功能的研究、分子育种和遗传改良带来了巨大的便利。锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）[6]和类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-likeeffector nucleases，TALENs）[7]技术是前期应用的两种基因组编辑技术，ZFNs和TALENs都是由识别蛋白和核酸内切酶两部分组成，识别蛋白引领核酸内切酶到识别靶位点，然后核酸内切酶在该位点对DNA进行切割产生DSBs，使其在随后的修复过程中产生基因序列的变化[8，9]。但这两种技术操作复杂，成本高昂，限制了其发展。

CRISPR/Cas9系统是第三代基因组编辑技术，来源于古细菌和细菌，Makarova等[10]将该系统分为三种类型：TypeⅠ，TypeⅡ，TypeⅢ。Jinek等[11]发现TypeⅡ的CRISPR/Cas9效应复合物结构简单，该系统中的Cas9蛋白是一种核酸酶，该酶与crRNA和tracrRNA结合就能对DNA進行切割，并且阐明了靶向DNA特定位点的原则。2013年，Cong等[12]直接利用短的特异性RNA引导Cas9核酸酶到人和小鼠的基因特定位点对DNA进行切割。当今在各种研究中应用最多的就是TypeⅡ类CRISPR/Cas9系统。该系统自2013年诞生以来，由于操作简便、价格低廉、准确度高而被广泛运用，成为基因组定点编辑的首选方法[13]。目前，CRISPR/Cas9系统已在拟南芥[14]、烟草[15]、水稻[16]、小麦[17]等植物中应用。

花生是重要的油料作物，种子的含油量在50%左右[18]。花生油中的脂肪酸主要由油酸和亚油酸组成，二者都为不饱和脂肪酸，含量占总脂肪酸的80%左右，且二者呈负相关[19]。因为油酸含有一个双键，亚油酸含有两个双键，因此油酸的化学性质更加稳定。油酸含量高的花生及其制品能够拥有更长的货架期[20]。AhFAD2基因编码ω-6脂肪酸脱氢酶，该酶控制油酸向亚油酸的转化。Abe等[21]通过CRISPR/Cas9介导的靶向突变破坏了OsFAD2-1基因，获得的水稻后代油酸含量为野生型的二倍。Wang等[22]发现AhFAD2基因家族有六个成员，其中AhFAD2-2为前人研究报道最多的一个成员，AhFAD2-1为新发现在种子中高度表达的一个成员。到目前为止，CRISPR/Cas9技术在花生基因功能研究中的应用鲜见报道。因此，本研究利用可以同时连接六个靶位点引物的CRISPR/Cas9载体，构建花生AhFAD2-1和AhFAD2-2基因多靶点CRISPR/Cas9载体，为接下来的遗传转化打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种与质粒 [HT]大肠杆菌感受态细胞DH5α和根癌农杆菌感受态细胞LBA4404购自郑州宝赛生物技术有限公司。sgRNA表达盒载体psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL和表达Cas9蛋白的植物遗传转化载体pEX-Cas9-At由中国科学院上海植物逆境生物学研究中心朱健康实验室馈赠。

1.1.2 主要试剂 [HT]BbsⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、XbaⅠ、XmaⅠ限制性内切酶购自New England Biolabs公司，T4 Ligase、碱性磷酸酶（alkaline  phosphatase）、KpnⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 靶位点序列的设计与引物合成 靶位点序列设计利用华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室和生物信息学中心开发的CRISPR-P 2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）在线软件设计。每个基因设计三个靶位点引物，根据对应的sgRNA表达盒载体上的酶切位点，在引物上添加酶切识别序列。本试验所用引物由北京六合华大基因公司合成，引物序列见表1。

1.2.2 sgRNA表达盒的构建

将质粒psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL和pEX-Cas9-At转化大肠杆菌DH5α，分别培养在含氨苄青霉素（50 μg/mL）和卡那青霉素（50 μg/mL）的固体LB培养基上，待长出菌落后，挑选单克隆扩大培养，提取质粒。载体构建流程见图1。

将靶位点引物用ddH2O溶解为100 μmol/L的母液，取各个靶位点的正向和反向引物各1 μL，再加入1μL的10×T4 Ligation Buffer，用ddH2O将体系补充到10 μL。将配好的体系放置于PCR仪中，设置程序为95℃ 5 min，然后以0.1℃/s的降温速度将温度降至25℃，完成靶位点引物的退火。

用BbsⅠ限制性内切酶对sgRNA表达盒载体psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL分别进行单酶切：各加入总量为1 μg的sgRNA表达盒载体psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL，1 μL BbsⅠ限制性内切酶，

3 μL的10×Cutsmart Buffer，用ddH2O将体系补充到30 μL，置于37℃反应2 h。用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，切下酶切完全的目的条带，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，回收产物置于-20℃下，用于后续试验。

退火后的靶位点引物与酶切后的sgRNA表达盒载体psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL进行连接：将退火后的靶位点引物稀释200倍到浓度为0.05 μmol/L，其中FAD2-1g1和FAD2-2g1分别与psgR-AtU6-26进行连接，FAD2-1g2和FAD2-2g2分别与psgR-AtU3b进行连接，FAD2-1g3和FAD2-2g3分别与psgR-At7SL进行连接，各反应体系加入1 μL稀释后的靶位点引物，分别加入總量为10 ng的各自相对应的sgRNA表达盒载体单酶切产物，1 μL的10×T4 Ligation Buffer，0.5 μL的T4 Ligase， 用ddH2O将体系补充到10 μL，置于16℃反应2 h。反应完后应用热激法转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含100 mg/L Amp的LB固体培养基上，倒置状态下37℃培养过夜。挑选单克隆，接种于含100 mg/L Amp的LB液体培养基中，在37℃、200 r/min的条件下振荡培养过夜。取菌液进行PCR检测，目标片段长度为360 bp，反应体系为：1 μL菌液，1 μL M13F（10 μmol/L），1 μL各靶位点的反向引物（10 μmol/L），10 μL 2×Taq PCR MasterMix，补充ddH2O至20 μL。扩增程序：95℃预变性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，进行30个循环;最后72℃延伸5 min。每一个连接体系挑选一个阳性克隆，提取质粒。

双酶切上一步获取的质粒，得到sgRNA表达盒。双酶切体系如下：各反应体系加入总量为2 μg的质粒，连接靶位点的psgR-AtU6-26质粒双酶切体系中加入1 μL HindⅢ和1 μL XhoⅠ，连接靶位点的psgR-AtU3b质粒双酶切体系中加入1 μL XhoⅠ和1 μL XbaⅠ，连接靶位点的psgR-At7SL质粒双酶切体系中加入1 μL XbaⅠ和1μL XmaⅠ，5 μL 10× Cutsmart Buffer，补充ddH2O至50 μL。体系置于37℃反应2 h。用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳后，psgR-AtU6-26质粒双酶切体系切下约470 bp的片段，psgR-AtU3b质粒双酶切体系切下约480 bp的片段，psgR-At7SL质粒双酶切体系切下约530 bp的片段，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，回收产物即为sgRNA表达盒。

1.2.3 FAD2-1和FAD2-2的三个sgRNA表达盒片段与pEX-Cas9-At载体的连接 pEX-Cas9-At质粒的双酶切：加入总量为2 μg的质粒，1 μL HindⅢ，1 μL XmaⅠ，5 μL 10× Cutsmart Buffer，补充ddH2O至50 μL。体系置于37℃反应2 h，然后加入

1 μL碱性磷酸酶，37℃反应1 h。利用苯酚-氯仿萃取法纯化双酶切后的产物，回收产物溶解在30 μL ddH2O中，-20℃保存。

由于每个基因的三个sgRNA表达盒酶切接头前后相连，因此在pEX-Cas9-At质粒的双酶切位点处可依次连上这三个sgRNA表达盒，连接体系为：在每个基因的连接体系中加入各为35 ng的三个sgRNA表达盒，95 ng pEX-Cas9-At质粒的双酶切回收产物，2 μL的10× T4 Ligation Buffer，1 μL T4 Ligase， 用ddH2O将体系补充到20 μL。体系置于16℃反应2 h。反应完后应用热激法转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含50 mg/L Kan的LB固体培养基上，倒置状态下37℃培养过夜。挑选单克隆，接种于含50 mg/L Kan的LB液体培养基中，在37℃、200 r/min的条件下振荡培养过夜。取菌液进行PCR检测，目标片段长度为1 400 bp，反应体系为：1 μL菌液，1 μL M13F（10 μmol/L），1 μL连接于psgR-At7SL上的靶位点反向引物（10 μmol/L），10 μL 2×Taq PCR MasterMix，补充ddH2O至20 μL。扩增程序：95℃预变性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，进行30个循环;最后72℃延伸5 min。每一个连接后转化挑选一个阳性克隆，提取质粒。

1.2.4 第二个sgRNA表达盒串联片段与pEX-Cas9-At载体的连接 用AtU6-F-KpnⅠ和sgR-R-EcoRⅠ引物对分别扩增上一步获得的连接有FAD2-1和FAD2-2三个sgRNA表达盒串联片段的pEX-Cas9-At载体，体系为：质粒200 ng，2 μL AtU6-F-KpnⅠ（10 μmol/L），2 μL sgR-R-EcoRⅠ（10 μmol/L），2×Pfu PCR MasterMix 25 μL，补充ddH2O至50 μL。扩增程序：95℃预变性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，进行30个循环;最后72℃延伸5 min。扩增完毕后，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳后，切下约1 400 bp处的片段凝胶，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，回收产物即为第二个sgRNA表达盒串联片段，置于-20℃下，用于后续试验。

用KpnⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶对上一步获得的回收产物和连接有FAD2-1和FAD2-2三个sgRNA表达盒串联片段的pEX-Cas9-At载体进行双酶切。反应体系为：0.5 μg第二个sgRNA表达盒串联片段/1 μg连接有FAD2-1或FAD2-2三个sgRNA表达盒串联片段的pEX-Cas9-At载体，1 μL KpnⅠ限制性内切酶，1 μL EcoRⅠ限制性内切酶，5 μL 10×Cutsmart Buffer，补充ddH2O至

50 μL。体系置于37℃反应2 h，然后加入1 μL碱性磷酸酶，37℃反应1 h。第二个sgRNA表达盒串联片段酶切后的纯化回收利用DNA纯化回收试剂盒进行，连接有FAD2-1和FAD2-2三个sgRNA表达盒串联片段的pEX-Cas9-At载体酶切后的纯化回收利用苯酚-氯仿萃取法，回收产物溶解在30 μL ddH2O中，-20℃保存。

将上一步酶切后回收的FAD2-1的sgRNA表达盒串联片段与上一步酶切后回收的连接有FAD2-2三個sgRNA表达盒串联片段的pEX-Cas9-At载体进行连接，连接体系为：95 ng FAD2-1的sgRNA表达盒串联片段，95 ng连接有FAD2-2三个sgRNA表达盒串联片段的pEX-Cas9-At载体，2 μL 10× T4 Ligation Buffer，1 μL T4 Ligase， 用ddH2O将体系补充到20 μL。体系置于16℃反应2 h。反应完后应用热激法转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含50 mg/L Kan的LB固体培养基上，倒置状态下37℃培养过夜。挑选单克隆，接种于含50 mg/L Kan的LB液体培养基中，在37℃、200 r/min的条件下振荡培养过夜。取菌液进行PCR检测，目标片段长度为1 200 bp，反应体系为：1 μL菌液，1 μL M13R（10 μmol/L），1 μL连接于psgR-AtU6-26上的靶位点正向引物（10 μmol/L），10 μL 2×Taq PCR MasterMix，补充ddH2O至20 μL。扩增程序：95℃预变性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，进行30个循环;最后72℃延伸5 min。挑选一个阳性克隆，提取质粒。

酶切后回收的FAD2-2的sgRNA表达盒串联片段与上一步酶切后回收的连接有FAD2-1三个sgRNA表达盒串联片段的pEX-Cas9-At载体的连接同上。

2 结果与分析

2.1 sgRNA表达盒的构建

用BbsⅠ限制性内切酶对sgRNA表达盒载体psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL分别进行单酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下约为3 100 bp的片段，纯化回收。退火后的靶位点引物与BbsⅠ限制性内切酶单酶切后的sgRNA表达盒载体进行连接，转化大肠杆菌，挑选单克隆，利用PCR进行鉴定，阳性克隆条带长约360 bp（图2）。各挑选一个阳性克隆扩大繁殖后提取质粒，进行双酶切，连接靶位点的psgR-AtU6-26质粒用HindⅢ和XhoⅠ双酶切，连接靶位点的psgR-AtU3b质粒用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，连接靶位点的psgR-At7SL质粒用XbaⅠ和XmaⅠ双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下约为500 bp的片段（图3），符合预期为470、480、530 bp的片段大小，回收产物即为sgRNA表达盒。

2.2 sgRNA表达盒与pEX-Cas9-At载体的连接

用Hind Ⅲ和XmaⅠ雙酶切pEX-Cas9-At载体，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下约为14 000 bp的片段（图4A），纯化回收。sgRNA表达盒与pEX-Cas9-At载体连接后转化大肠杆菌，挑选单克隆，利用PCR进行鉴定，阳性克隆条带长约为1 400 bp（图4B）。各挑选一个阳性克隆扩大繁殖后提取质粒。

2.3 第二个sgRNA表达盒串联片段与pEX-Cas9-At载体的连接

用AtU6-F-Kpn Ⅰ和sgR-R-EcoR Ⅰ引物对扩增已经连接上sgRNA表达盒的pEX-Cas9-At载体，获得第二个sgRNA表达盒串联片段，扩增产物长约1 400 bp（图5A），电泳后切下目标片段，纯化回收。

pEX-Cas9-At载体的第二个连接位点需用KpnⅠ和EcoRⅠ限制酶进行切割，且上一步获得纯化产物带有KpnⅠ和EcoRⅠ限制酶切位点，因此对载体和纯化回收产物双酶切后进行连接反应。连接后转化大肠杆菌，挑选单克隆，利用PCR进行鉴定，阳性克隆条带长约为1 200 bp（图5B）。对获得的阳性克隆进行测序鉴定，验证目的序列是否正确插入，结果证明序列正确插入（图6），载体构建成功。

3 讨论与结论

CRISPR/Cas9是一种简单、高效的基因编辑系统，针对不同的基因，每次只需要设计一个或多个该基因的特异sgRNA即可，相比锌指核酸酶（ZFNs）和类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）技术，CRISPR/Cas9节约了大量的时间、人力和物力，大大推动了基因基础研究的发展。

本研究构建的CRISPR/Cas9载体同时包含FAD2-1基因的三个靶位点和FAD2-2基因的三个靶位点，且两个sgRNA表达盒串联片段所处位置不同。在单个载体中携带多个基因和多个靶位点，不仅能够大大减少载体构建的时间，还能够增加CRISPR/Cas9系统的编辑效率，可以同时敲除多个基因。Ma[23]同时靶向一个基因家族的多个（多达8个）成员，并且自T0代水稻和T1代拟南芥中得到了多个位点突变的个体。赵恒等[24]构建了靶向BnSVP的 CRISPR /Cas9 基因组编辑载体，应用双靶点策略，对4个或2个同源基因进行同时敲除。这与本试验的载体构建思路类似，在接下来的遗传转化试验中，我们期望可以得到多个基因位点同时突变的个体。

启动子对CRISPR/Cas9系统行使功能十分重要，应用合适的启动子，CRISPR/Cas9系统才能在转化受体内发挥作用。本试验构建的载体使用的是pAtU6-26、pAtU3b、pAt7SL和pAtUBQ，主要用于拟南芥CRISPR/Cas9系统。目前，还没有针对花生CRISPR/Cas9系统专门设计启动子，因此，我们首先会尝试使用这些启动子，在接下来的遗传转化试验中验证其在花生中是否具有启动转录功能，也可以利用花生自身的启动子驱动sgRNA和Cas9蛋白的表达。石磊等[25]获得的AhSAD基因的启动子为组成型表达，在以后的试验中可以将其应用于花生的CRISPR/Cas9系统。此外，还可以对CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白的编码基因进行优化，使其在花生中能够更好地翻译表达，建立适合花生的CRISPR/Cas9基因组编辑体系，推动花生的基因功能研究、分子育种等工作的快速发展。

本研究通过将花生FAD2-1和FAD2-2基因的gRNA与sgRNA骨架连接，双酶切获得sgRNA表达盒，然后分别将两个基因的sgRNA表达盒串联连接到pEX-Cas9-At载体，获得含有单个基因sgRNA表达盒串联片段的重组载体，而后通过利用含有酶切位点的引物进行PCR，获得sgRNA表达盒串联片段，分别与已含有另一个sgRNA表达盒串联片段的重组载体再次连接，获得同时针对两个基因且sgRNA表达盒串联片段所处位置不同的重组载体。成功构建了针对花生FAD2-1和FAD2-2的多靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体。

参 考 文 献：

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收稿日期：2019-07-24

基金项目：国家自然科学基金项目（U1704232）;河南省产业技术体系项目（S2012-05-G03）

作者简介：李柯（1995—），男，河南南阳人，硕士研究生。

通讯作者：殷冬梅（1972—），女，河南南阳人，博士，教授，主要从事花生遗传育种工作。E-mail：yindm@126.com