俞芳菲 冯长春 王勇 刘东阳 卢燕回 江连强 杨举田 王杰 杨金广 张瑞平

摘  要：為探明申嗪霉素防治烟草黑胫病的潜力，在室内离体条件下测定其对烟草黑胫病菌菌丝生长、孢子囊形成和游动孢子释放的毒力，并通过温室盆栽和大田药效试验明确其对烟草黑胫病菌的防效及对烟草生长的影响。结果表明，申嗪霉素对沂水烟区黑胫病菌孢子囊的形成和游动孢子的释放抑制效果最好，EC₅₀值分别为0.31和0.35 ?g/mL。室内防效结果表明，1%申嗪霉素悬浮剂（15 g a.i./hm²）对烟草黑胫病的防效为84.37%，显著高于25%甲霜灵可湿性粉剂（56.33%）和50%烯酰吗啉可湿性粉剂（80.55%），而田间药效试验结果与室内防效基本一致，在冕宁和诸城两地1%申嗪霉素田间防效分别为90.49%和82.93%，显著高于对照药剂甲霜灵（71.89%，38.87%）和烯酰吗啉（78.42%，69.01%）。除此之外，申嗪霉素较甲霜灵和烯酰吗啉在提高株高、茎粗、有效叶片数及光合速率等指标效果更好。可见，申嗪霉素是防治烟草黑胫病的有效制剂，可作为甲霜灵和烯酰吗啉的轮换药剂使用。

关键词：烟草黑胫病;申嗪霉素;敏感基线;盆栽试验;田间防效

中图分类号：S435.72          文章编号：1007-5119（2019）05-0030-06      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.05.005

Abstract：To explore the potential of antibiotic biocontrol agents Shenqinmycin to control tobacco black shank disease， the inhibitory effects of Shenqinmycin on mycelial growth， sporangia formation and zoospores release ofPhytophthora nicotianaewas investigated in vitro. The effects of Shenqinmycin on the control of tobacco black shank and the growth of tobacco plant were determined based on greenhouse experiments and field trials. The results showed that Shenqinmycin had the best inhibitory effect on sporangia formation and zoospores release ofP. nicotianaein Yinshui with EC₅₀of 0.31 and 0.35 ?g/mL， respectively. The results of greenhouse pot experiment indicated that the control effect of 1% Shenqinmycin suspension on tobacco black shank at 15 g a.i./ha was 84.37%， which was significantly higher than that of 25% metalaxyl （56.33%） and 50% dimethomorph （80.55%）， whereas the field trial results were basically consistent with the control effect of greenhouse experiments. Field efficacy trials in Mianning and Zhucheng showed that the application of Shenqinmycin can significantly reduce tobacco black shank to occurrence， and the control effect on tobacco black shank in Liangshan and Zhucheng was 90.49% and 82.93%， which was significantly higher than the control agents metalaxyl （71.89%， 38.87%） and dimethomorph （78.42%， 69.01%）. In addition， Shenzinmycin has better effects on the increase of plant height， stem diameter， effective leaf number and photosynthetic rate than that of metalaxyl and dimethomorph. The results of the present study indicate that Shenqinmycin can be used as an alternative agent for metalaxyl and dimethomorph to control tobacco black shank.

Keywords：tobacco black shank; Shenqinmycin; sensitive baseline; pot experiment; field control

基金项目：四川省烟草公司凉山州公司科技项目“基于免疫调控的病毒病绿色防控技术研究与应用”（LSYC201810）;广西壮族自治区烟草公司科技项目“广西烟草绿色防控重大专项技术研究与推广应用”（201745000024095）烟草黑胫病是一种土传病害，由烟草黑胫病菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）所引发，一直是烟叶生产中危害最为严重的病害之一^[1]。化学杀菌剂是防治烟草黑胫病的主要药剂，目前登记在册可以防治疫霉类的杀菌剂主要有苯胺类、羧酸酰胺类、丙烯酸酯类、烷基盐酸盐类、恶唑类、氨基酸类等，常用药剂为嘧菌酯，烯酰吗啉，氟啶胺以及甲霜灵等^[2-4]。但由于化学药剂的滥用及对病原菌的高度选择性，致使高抗药性病原菌的产生，从而使这些常规药剂对烟草黑胫病的防治效果下降，不能满足生产需求^[5]。例如，YANG等^[6]发现已有烟草黑胫病菌株对甲霜灵产生抗药性，胡燕等^[7]同样发现了对烯酰吗啉存在抗性风险的烟草黑胫病菌。因此，迫切需要开发有效，安全和环保的杀菌剂替代當前常规药剂。

申嗪霉素是由铜绿假单胞杆菌M18菌株分泌的，含有两种活性成分（A和B）的26位大环内酯类抗生素，高效、低毒、无残留，可以有效防治瓜类枯萎病（Fusarium）、辣椒疫病（Phytophora capsici）和水稻纹枯病（Rhizoctonia solani）^[8-9]。目前登记作物和防治对象包括水稻纹枯病、稻瘟病、小麦全蚀病、赤霉病、黄瓜灰霉病、霜霉病、辣椒疫病和西瓜枯萎病^[10]。申嗪霉素用于防治烟草病害的应用还没有取得正式登记，为了进一步评价申嗪霉素对烟草黑胫病菌不同生长发育阶段的抑制作用及对黑胫病的防治效果，明确其应用潜力，采用离体活性测定方法测定申嗪霉素对烟草黑胫病菌的菌丝生长、游动孢子囊形成以及游动孢子释放的影响，同时采用离体叶片法和喷淋茎基部法分别测定申嗪霉素对烟草黑胫病的防治效果，以期为申嗪霉素作为防控烟草黑胫病的替代药剂，提供技术支撑。

1  材料与方法

1.1  供试材料

供试病原菌：采自4地（山东诸城、沂水、广西靖西、四川冕宁）烟草黑胫病茎秆，经实验室分离，得单孢子囊菌株80株。灭菌燕麦琼脂（OA）培养基，用于菌丝敏感性测定。

供试烟草品种：室内试验烟草品种小黄金1025，由中国农业科学院烟草研究所提供。田间试验烟草品种为云烟87。

供试药剂：95%申嗪霉素原粉和1%申嗪霉素悬浮剂，由上海农乐生物制品股份有限公司提供;甲霜灵（98%）和烯酰吗啉原粉（97%），由山东省联合农药工业有限公司提供;25%甲霜灵可湿性粉剂和50%烯酰吗啉可湿性粉剂，购于德国拜耳作物科学公司;氟吡菌胺（98%）和霜霉威盐酸盐原粉（92%），由济南绿霸农药有限公司提供;95%嘧菌酯原粉，由山东潍坊润丰化工股份有限公司提供。

1.2  试验方法

1.2.1  申嗪霉素对烟草黑胫病菌菌丝生长、孢子囊形成和游动孢子释放的影响  根据许学明^[11]和战徊旭等^[12]的描述，采用菌丝生长速率法，测定申嗪霉素对烟草黑胫病菌株菌丝生长的影响。将烟草黑胫病菌置于OA平板25 ℃黑暗培养4 d后，打取5 mm菌饼放置于含系列浓度药剂的OA平板中央。申嗪霉素供试浓度为0，0.1，0.5，1.0，2.5和5.0 ?g/mL，对照药剂甲霜灵最终有效浓度为1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 mg/L，烯酰吗啉最终浓度为0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L，氟吡菌胺最终浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L，霜霉威盐酸盐最终浓度为1.00、2.00、4.00、8.00、10.00 mg/L，各处理均重复3次。25 ℃恒温暗培养5 d。采用十字交叉法量取菌落直径，参照下列公式计算抑制率。

根据MATHERON等^[13]描述的方法测定申嗪霉素对烟草黑胫病菌孢子囊形成的影响。申嗪霉素终浓度为0，0.05，0.1，0.5，0.75和1.0 μg/mL，以含有相同体积无菌水的培养皿为对照。在10×10倍下镜检酸性品红染色的孢子囊数量，每处理随机检测一个视野，4次重复。

根据MIAO等^[14]描述的方法测定申嗪霉素对烟草黑胫病菌游动孢子释放的影响。申嗪霉素终浓度为0，0.05，0.1，0.5，0.75和1.0 μg/mL，以同体积的无菌水为空白对照。以孢子囊内含物完全为

空时视为释放。统计其游动孢子的释放情况，每处理3次重复。

1.2.2  室内防效试验  试验于2018年7月在中国农业科学院烟草研究所内进行。选取生长一致的5～6叶期的健康苗，分别以每株20 mL 1%申嗪霉素悬浮剂（15 g a.i./hm²）、25%甲霜灵可湿性粉剂（375 g a.i./hm²）、50%烯酰吗啉可湿性粉剂（300 g a.i./hm²）药液进行茎基部喷淋处理，清水为对照。施药当天定义为0 d，3 d后接种烟草黑胫病菌孢子悬浮液（10⁶cfu/mL），每株接种菌液50 mL至烟苗茎基部，脱脂棉保湿48 h，温室培养28 d [温度（27±1 ℃），相对湿度95%]。共施药1次，每个处理重复4次，每个处理20株烟苗。记录烟草黑胫病发病株数和病级。按照下列公式进行计算。

1.2.3  申嗪霉素对烟草生长的影响  施药当天记录为0 d，对处理后28 d的株高、茎粗、有效叶片数及光合速率等指标进行统计分析。

1.2.4  大田防效试验  试验地点为山东省诸城市郝戈庄镇（E 119°43′，N 35°85′）和四川省冕宁县回坪烟站（E 102°14′，N 28°52′）烟草黑胫病多发地块。随机区组设计，每个处理重复4次，并在小区前后设立隔离保护行。诸城和冕宁两地分别于5月9日和4月21日选取生长一致无病壮苗进行井窖式移栽，行距1.10～1.20 m，株距0.45～0.50 m，移栽当天进行第一次茎基部药剂喷淋处理，施用剂量为20 mL/株。于发病初期（6月28日和7月4日）进行第2次施药。大田施肥与管理按照当地优质烟叶技术操作规程进行。烟株打顶后，对小区内烟株农艺性状的调查参照YC/T142—2010进行;烟草黑胫病的发病率和病情于2次施药后第30、60天按国家标准GB/T 23222—2008烟草病虫害分级及调查方法进行。

1.3  数据处理

运用SPSS 16.0 软件对数据进行单因素方差分析（ANVOA），采用LSD法进行差异显著性检验。基于SPSS的PROC GLM对log 10杀菌剂浓度的相对抑制率进行回归分析，计算各種药剂抑制菌丝生长、孢子囊形成和游动孢子释放的EC₅₀。

2  结  果

2.1  申嗪霉素对烟草黑胫病菌毒力测定

选取2015—2017年期间从南北4个烟草主产区采集的80个菌株进行申嗪霉素对烟草黑胫病菌的毒力测定，结果发现申嗪霉素对烟草黑胫病菌菌丝生长、孢子囊形成和游动孢子释放均表现很强的抑制作用（表1），其中申嗪霉素对冕宁地区分离菌株菌丝生长抑制活性最高，平均EC₅₀值为0.71 ?g/mL，而对沂水烟区黑胫病菌孢子囊的形成和游动孢子的释放抑制作用更高，EC₅₀均值为0.31和0.35 ?g/mL。但是在菌丝生长和孢子囊形成阶段，申嗪霉素对冕宁、沂水和诸城烟区菌株的毒力作用无显著差异。

选取40个菌株进行烟草黑胫病菌对申嗪霉素和5种常用化学杀菌剂敏感性比较（表2）。室内毒力测定结果显示，申嗪霉素对菌丝生长抑制活性最高，EC₅₀值最低，为0.15 ?g/mL，与氟吡菌胺和嘧菌酯相比（EC₅₀为0.20和0.22 ?g/mL）无明显差异。

甲霜灵EC₅₀值最高10.24 ?g/mL，其次为烯酰吗啉（2.01 ?g/mL）和霜霉威盐酸盐（3.30 ?g/mL）。

2.2  申嗪霉素对烟草黑胫病防效的温室盆栽试验

2.2.1  申嗪霉素对烟草黑胫病的防治效果  室内防效测定结果（表3）表明，未经杀菌剂处理的烟株发病率达85.43%，病情指数为69.25。而申嗪霉素可显著降低烟草黑胫病的发病率，相对防效达84.37%，与烯酰吗啉相当，但显著高于对照药剂甲霜灵。

2.2.2  申嗪霉素对烟株生长指标的影响  盆栽结果表明，申嗪霉素可显著增加烟株株高、茎粗、有效叶片数和光合速率（表4），相比于空白对照均有不同程度的提高。申嗪霉素处理的烟株平均株高、平均茎粗分别是24.32和6.84 cm、光合速率为8.89 μmol/（m²?s），分别比甲霜灵和烯酰吗啉处理植株增加33.88%、25.43%、47.35%和16.17%，19.88%、32.17%。而甲霜灵和烯酰吗啉处理组烟株茎粗、有效叶片数和光合速率较对照无明显差异。由此可知申嗪霉素的施用有助于烟叶光合产物的积累，对烟株表现出良好的促生效果。

2.3  申嗪霉素防治烟草黑胫病的田间防效

冕宁烟区田间药效试验表明，相对于对照区，申嗪霉素、烯酰吗啉和甲霜灵均能够显著减轻处理区烟草黑胫病的发病程度，降低其发病率（表5）。申嗪霉素处理区发病率为22.47%，病情指数为4.77，防效为90.49%，显著高于烯酰吗啉和甲霜灵的防效。与甲霜灵处理比较，烯酰吗啉处理区发病率和病情指数均有降低，但二者无显著性差异。诸城烟区田间药效试验结果与冕宁烟区基本一致（表6），与空白对照区相比，申嗪霉素显著降低了烟草黑胫病发病率，大幅降低了烟草黑胫病的病情指数，防效显著高于烯酰吗啉和甲霜灵。而烯酰吗啉对该地区烟草黑胫病防治效果明显优于甲霜灵。

3  讨  论

申嗪霉素是一类高效、广谱、安全的生物杀菌剂。张博等^[15]采用生长速率法发现申嗪霉素对马铃薯晚疫病的毒力最强，EC₅₀值为2.0243 mg/mL。XIANG等^[16]研究表明，申嗪霉素对水稻纹枯病表现出较好的抑制作用，其EC₅₀为9.0934 ?g/mL。ZHAO等^[17]研究发现与嘧菌酯、多抗霉素和戊唑醇相比，申嗪霉素对茶白星病病原菌抑制效果最好，EC₅₀值为0.74 ?g/mL。本研究采用菌丝生长速率法对四川冕宁、广西靖西、山东沂水和诸城4个产烟区分离到的黑胫病菌进行了申嗪霉素敏感性测定，发现申嗪霉素可有效抑制病菌的生长，平均EC₅₀值0.15 ?g/mL，毒力优于常规化学杀菌剂甲霜灵和烯酰吗啉，与朱流红^[18]和高亚星等^[19]对贵州省惠水县等主要产烟区分离的黑胫病菌室内毒力测定结果基本一致。对病原菌不同生长发育阶段的影响进一步研究，发现申嗪霉素对黑胫病菌孢子囊的形成和游动孢子释放的抑制作用较对菌丝生长的抑制作用更大。同时结合前人关于申嗪霉素不能在植株体内上下传导，其作用方式仅是保护植株和预防病原菌的侵入的研究结果^[20]可知，申嗪霉素对烟草黑胫病同时具有保护和治疗作用，在病害发生的不同阶段均可使用其进行防治，尤其在孢子囊形成之前施用该类药剂可有效抑制病原菌的再侵染及病害的发展蔓延。另外，从敏感性测定结果分析发现，来自南北方不同环境条件下的菌株对申嗪霉素敏感性差异较大，究其原因可能为我国南方土壤呈酸性，有利于申嗪霉素有效成分吩嗪-1-羧酸的活性稳定。而不同地区病原菌来源及用药史对其敏感性也有一定的影响。

田间药效试验表明，1%申嗪霉素悬浮剂喷施对油菜菌核病、棉花枯?黄萎病、茄子黄萎病、小麦赤霉病、苹果斑点落叶病和水稻苗床立枯病有较好的防治效果，防效达到69%～85%^{[7-8，11，16]}。申嗪霉素虽然没有被登记用于防治烟草黑胫病，但本研究发现申嗪霉素在离体条件下对烟草黑胫病菌有强烈的抑制作用，对40株田间采集的菌株平均EC₅₀值为0.15 ?g/mL。室内盆栽和田间药效试验结果表明1%申嗪霉素悬浮剂（15 g a.i./hm²）对烟草黑胫病防效明显高于对照药剂甲霜灵和烯酰吗啉，于移栽期和团棵期茎基部喷淋处理各1次，对烟草黑胫病害抑制作用显著，防效最高达90.49%。且测试剂量下，申嗪霉素对烟草株高、茎粗、有效叶片数、光合速率、叶面积等农艺指标有较明显的促进作用。由此可见，在烟草黑胫病菌对甲霜灵、烯酰吗啉等药剂的抗药性逐年加重的情况下，申嗪霉素可成为防治烟草黑胫病的替代药剂。

4  结  论

结果表明，申嗪霉素对黑胫病菌不同的生长发育阶段均有抑制作用，尤其在孢子囊形成之前施用该类药剂可有效抑制病原菌的再侵染及病害的发展蔓延。1%申嗪霉素悬浮剂（15 g a.i./hm²）于移栽期和团棵期茎基部各喷淋处理1次对黑胫病菌的防效显著，防效最高达90.49%，同时在推荐剂量下申嗪霉素对烟株生长发育有促进作用。具体的促生机制以及申嗪霉素与杀菌剂复配对烟草黑胫病防控效果有待进一步研究。

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