高秀花，刘旭光，晋 松，杨慎峭，周海燕，杨 馨，贾 敏

(1.成都中医药大学附属医院，成都 610072；2.成都中医药大学，成都 610075；3.包头医学院第二附属医院，内蒙古 包头 014000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，主要由T淋巴细胞介导，RA病因及发病机制复杂，缠绵难愈，属国内外广泛关注的疑难疾病。RA发病机制主要是CD4+T淋巴细胞分化异常，既往研究认为辅助性T细胞1(T helper cells 1，Th1)/辅助性T细胞2(T helper cells 2，Th2)平衡在RA的发生发展中发挥着重要作用[1]。然而随着研究的深入和辅助性T细胞17(T helper cells 17，Th17)、调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)的发现，人们认识到Th17/Treg失衡在RA的发生发展中至关重要，且RA存在向Th17方向偏离的现象[2]。因此以Treg/Th17为靶点治疗RA的研究逐渐受到关注，如获得临床满意疗效的抗IL-17 A 和IL-17RA抗体的研究，但其不良反应不可忽视[3]。

艾灸治疗RA安全无毒副作用，抗炎及免疫调节作用确切，但艾灸能否影响RA中Th17/Treg平衡尚未见报道。为进一步阐释艾灸的科学内涵和作用机理，我课题组基于前期课题研究，从艾灸治疗RA的抗炎作用出发，以Th17/Treg平衡为切入点，运用ELISA、RT-PCR等技术，从对Th17/Treg细胞相关细胞因子白细胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)/白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)以及Th17/Treg细胞关键转录因子维甲酸相关孤儿受体γt(Retinoid related orphan receptor，RORγt)/叉头样转录因子P3(Foxhead box protein 3，Foxp3)表达的影响，分别探索艾灸对RA中 Th17/Treg平衡的影响，以期更加深入地揭示艾灸的作用机理。

1 材料

1.1 动物

日本大耳白兔30只(动物、饲料均由成都中医药大学动物实验中心提供，批号SCXK(川)2008-14，合格证号川实动管字089号)，雌雄各半，体质量(2.5±0.25)kg，实验过程中所有处置符合相关动物伦理学要求。

1.2 主要试剂及仪器

弗氏完全佐剂Sigma公司(货号Lot101M8711)；兔IL-17、IL-10 ELISA试剂盒(Abcam公司，货号分别为DRE95204、DRE95029)；总RNA抽提试剂(Invitrogen公司，批号15596-026)；酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司，型号Multlskan Mk3)；RT-PCR仪(ThermoFisher仪器有限公司，型号PIKORed 96)；电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，型号JY200C)；RT-PCR反应试剂盒、RNA提取及反转录试剂盒(宝生物工程有限公司，批号分别为BK402、BK3303、BK501)；艾粒(中国南阳东升艾灸厂，规格Ф6.8×26 mm，批号2014032)。

2 方法

2.1 动物分组与模型制备

适应性驯养家兔7 d后，将家兔按随机数字表法分为空白对照组(简称“空白组”)、RA模型组(简称“模型组”)、艾灸治疗组(简称“治疗组”)3组各10只。

选用RA经典动物模型造模：驯养7 d后，将治疗组、模型组家兔双侧后膝关节剃毛暴露，10%异丙醇进行皮肤消毒，轻度屈曲膝关节，定位膝关节髌骨下缘、髌韧带外侧凹陷为穿刺点，按0.5 ml/kg体质量剂量将弗氏完全佐剂平均注入家兔双侧后膝关节腔内，同法空白组家兔注入无菌生理盐水[4]。

2.2 治疗

于造模后1周将治疗组家兔固定在兔架上，暴露施灸部位(每处剃毛约2×2 cm2)，参照《实验针灸学》[5]的动物穴位图谱，将艾粒黏贴于双侧“足三里”“肾俞”穴，每穴连续施灸5壮，每日1次，6 d为1个疗程，疗程期间休息1 d，共治疗3个疗程。空白组和模型组同法抓取固定，但不施灸。3组同步，操作均在上午9∶00～11∶00之间进行。

2.3 膝关节周长测定

分别于造模前后及治疗第1、2、3周测定所有家兔的左右后肢膝关节周长，测量使用软尺过膝关节髌骨下缘、髌韧带外侧凹陷的穿刺点。

2.4 取样及指标检测

治疗第3周结束(治疗第21天)，于9∶00～11∶00间进行标本采集。

2.4.1 滑膜液抽取及相关指标检测 耳缘静脉注射空气处死家兔，分别在双侧膝关节腔内注射生理盐水0.3 ml，轻揉局部后无菌条件下抽吸关节腔中滑膜液约0.3 ml装入EP管，-20 ℃低温保存。根据试剂盒说明书，运用ELISA双抗夹心法测定滑膜液量中IL-10、IL-17，并计算IL-10/IL-17比值。

2.4.2 滑膜组织取材及相关指标检测 抽取滑膜液后，沿着双后膝关节正中线纵行剖开皮肤，直至暴露以膝关节为中心的区域大小约为3×3 cm2，使用齿镊提起髌骨，沿髌骨上缘大约0.3～0.4 cm处向下切至股骨，再沿髌骨两侧向下分离到胫骨，肉眼可见一层淡黄色滑膜组织自髌骨下缘向上延续。完全暴露滑膜组织，用眼科镊轻夹其游离端，使用刀片完整切下，-70 ℃保存待测。运用RT-PCR法测定滑膜组织中Foxp3mRNA、RORγtmRNA表达量，并计算Foxp3/RORγt比值。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 艾灸对实验性RA家兔膝关节周长影响

表1 3组家兔双侧膝关节周长比较

注:与空白组比较:**P<0.01；与模型组比较:△△P<0.01

表1显示,造模前，各组家兔双侧膝关节周长比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性；造模后，模型组、治疗组双侧膝关节周长均较空白组有明显升高(P<0.01)，而2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，说明造模成功。治疗第1、2、3周，模型组双侧膝关节周长较空白组均明显升高(P<0.01)，而治疗组较模型组均明显降低(P<0.01)。

3.2 艾灸对实验性RA家兔滑膜液Th17/Treg相关细胞因子IL-17/IL-10含量以及滑膜组织Th17/Treg关键转录因子RORγt/Foxp3表达的影响

表2显示,与空白组比较，模型组滑膜液中IL-10含量偏低(P<0.05)，IL-17含量明显偏高(P<0.01)，IL-10/IL-17值明显偏低(P<0.01)；滑膜组织中Foxp3mRNA的表达存在下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，RORγtmRNA表达则升高(P<0.05)，Foxp3/RORγt值降低(P<0.05)。与模型组比较，治疗组IL-10含量偏高(P<0.05)，IL-17含量偏低(P<0.05)，IL-10/IL-17值偏高(P<0.05)；Foxp3mRNA表达存在升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；RORγtmRNA表达降低(P<0.05)，Foxp3/RORγt值存在升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 3组家兔滑膜液中IL-10、IL-17含量及滑膜组织中Foxp3mRNA、RORγtmRNA表达量比较

注：与空白组比较：*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05

4 讨论

RA属于系统性、自身免疫性疾病，其病因及其发病机制尚不明确[6]。滑膜炎症为主要病理改变，其临床表现为对称性发生的多关节炎，表现为局部红、肿、热、痛。因此，本实验选择测量日本大耳白兔的膝关节周长，从宏观角度判断炎症程度。根据实验结果，本研究造模成功，通过对3组家兔的充分比较说明艾灸具有明显的消肿和抗炎作用。

随着现代免疫学的不断发展，大量的研究发现，Th17/Treg失衡存在于包括RA在内的多种自身免疫性疾病中，且此平衡有向Th17方向偏离的现象，以Th17/Treg平衡为靶点对RA治疗的研究也越来越受到关注。Park和Harrington于2005年首次提出“Th17细胞”的概念，它是在转录因子RORγt调控下以分泌IL-17为主要特点的新型Th细胞亚群，是重要的致炎细胞[7-8]；Sakaguchi于上世纪90年代首先提出Treg的概念，是一群具有免疫负性调节功能的CD4+T细胞[9]，主要通过分泌IL-10抑制炎症反应，特异性表达转录因子Foxp3，可以降低RORγt表达，从而抑制Th17细胞功能。Treg细胞与Th17细胞的生物学作用既相互拮抗又相互关联，保持动态平衡，对正常免疫应答的维持、防止自身免疫性疾病的发生具有非常重要的意义。因此，纠正Th17/Treg失衡状态将会成为RA治疗的新思路和新方法。

RA属于中医学“痹症”范畴，“内外相合”因而致痹，因此其病机关键是邪正交争中的邪侵与正虚[10]，病性属于“虚实夹杂”或“本虚标实”，致机体经络闭阻，不荣则痛或不通则痛。《灵枢·官能》中“针所不为，灸之所宜”是对灸法的高度评价，并善于温经通络止痛、扶阳补肾固本。故本实验治疗同样选用先后天之本同固的“肾俞”“足三里”穴，共奏温肾健脾、补益气血、活血化瘀、疏通经络标本同治之效[11]。

已有大量临床及基础研究证实，RA的治疗中艾灸疗效确切，具有明显的抗炎及免疫调节作用。如艾灸能明显改善Th1/Th2细胞因子失衡[12]、胸腺萎缩和脾脏肿大等免疫紊乱状态，明显抑制滑膜炎症和滑膜细胞分泌炎症介质、细胞因子[13-14]等。本实验着重观察艾灸对实验性RA Th17/Treg平衡的影响，研究发现模型组滑膜液中IL-10含量低于空白组，IL-17则明显升高，IL-10/IL-17值明显降低，提示RA中存在Th17/Treg细胞因子失衡，且有向Th17方向偏离的现象；治疗后IL-10含量高于模型组，IL-17则降低，IL-10/IL-17值亦升高。提示艾灸能够有效升高实验性RA滑膜液中异常降低的IL-10水平，降低异常升高的IL-17水平，升高异常降低的IL-10/IL-17比值，从而有效调整Th17/Treg相关细胞因子平衡。与空白组比较，模型组滑膜组织Foxp3mRNA表达有下降趋势(但差异无统计学意义)，RORγtmRNA表达则升高，Foxp3/RORγt比值降低，提示实验性RA中存在Th17/Treg关键转录因子表达失衡，且有向Th17方向偏离的现象；治疗后Foxp3mRNA表达有升高趋势(但差异无统计学意义)，RORγtmRNA表达则降低，Foxp3/RORγt比值有升高趋势(但差异无统计学意义)。提示艾灸能够有效升高异常降低的Foxp3表达水平，降低RORγt的异常高表达，可能使异常降低的Foxp3/RORγt比值升高，从而有效调整Th17/Treg细胞关键转录因子平衡。

综上所述，本实验认为艾灸对实验性RA具有确切的抗炎效应，可调节实验性RA的 Th17/Treg平衡，这可能就是艾灸抗炎作用的重要机制之一。因实验当时Th17、Treg细胞相关抗兔流式抗体生产滞后，本课题未能使用流式细胞术检测，今后条件成熟，可以直接运用流式细胞术等检测技术，对Th17、Treg细胞的理化特性进行检测，可更加直接准确地研究艾灸对Th17/Treg平衡的影响。