胡礼聪，吴奋飞，包华健

(浙江省丽水市中心医院药剂科，丽水 323000)

近年来，超顺磁性纳米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)作为一种新型药物载体而被广泛用于疾病的治疗，尤其是在肿瘤靶向治疗领域[1-2]。其特有的超顺磁性可被用于磁靶向治疗，通过外加磁场直接将药物靶向到肿瘤部位，从而实现靶向治疗。国内外研究报道证实：在一定外磁场的作用下，SPIONs可以穿过血-脑屏障(blood brain barrier，BBB)，这为其成为脑部疾病的药物递送载体提供强有力的基础[3]。此外，裸露的SPIONs表面通过适当的修饰可调节和改变磁性纳米粒的稳定性和分散性，提高其抗氧化性，还可以为纳米粒提供表面功能性，如生物相容性、接枝反应活性及特异性识别等功能[4]，这些优点都使SPIONs成为脑胶质瘤药物治疗的最佳载体。本次实验在前期研究基础上以SPIONs作为多功能纳米颗粒的核心，用于磁靶向，将新型材料聚乙二醇/聚乙烯亚胺(PEG/PEI)涂覆在SPIONs的表面，构建新型的PEG-PEI修饰SPIONs，以减少巨噬细胞对SPIONs的吞噬，延长SPIONs在血液中的循环时间，同时又为化学治疗(化疗)药物提供载药位点。然后以传统化疗药物多柔比星(doxorubicin，DOX)为模型药物通过静电吸附的方法载入上述修饰后的SPIONs中，辅助以外磁场的引导，克服BBB屏障，将药物靶向递送到脑部肿瘤组织，实现胶质瘤的靶向药物治疗。通过在核磁共振影像学(MRI)、离体组织病理学等方法综合评价新型载药SPION结合外加磁场对脑胶质瘤靶向药物治疗的效果。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康成年无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠48只，购于温州医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2015-0001，合格证号：wydw2013-0050，饲养环境：温度为 21～23℃，相对湿度为 57%～65%，昼夜明暗交替时间为12 h/12 h，洁净度一万级，噪音≤60 dB，照度150～300 Lx，自由摄食饮水。

1.2试药 盐酸多柔比星(阿拉丁试剂有限公司，批号：M0302A，含量：98%)，聚乙二醇(PEG，相对分子质量1000，汕头市西陇化工有限公司，批号：20120413)，聚乙烯亚胺(PEI，相对分子质量1800，阿拉丁试剂有限公司，批号：20120413，含量：99%)，乙酰丙酮铁[TCI(东京)化成工业株式会社，批号：F1518083，含量：>98%]，大鼠C6胶质瘤细胞(资源编号：3131C0001001000001，中国科学院上海细胞库)。

1.3实验仪器 磁铁(圆盘状，直径2 cm，磁场强度0.3T，广州捷玛磁铁材料厂)，JEM-1230透射电子显微镜(日本电子公司)，纳米粒度Zeta电位分析仪(ZEN 3690，英国Malvern仪器公司)，WDT-V型脑立体定向仪，小型颅钻，ST-III型三维手动推进仪 (西安西北光电医疗器械厂)；Signa3.0T磁共振成像仪(GE公司)；大鼠扫描专用线圈(上海晨光公司)。

1.4PEG/PEI修饰的DOX-SPIONs合成及其表征 铁源为乙酰丙酮铁[Fe(acac)3]，通过高温热分解法制备SPIONs。为了减少裸露SPIONs的毒性，课题组以PEG为溶剂，PEI为添加剂制备PEG/PEI共同修饰的SPIONs(PEG/PEI-SPIONs)，见图1。再将处方量多柔比星(doxorubincin，DOX)通过物理吸附和静电吸附的方法载入SPIONs里面，最后用磁性分选柱分选出载药纳米粒，同时收集未载入的DOX溶液，使用紫外分光光度法测定载药量和包封率。包封率(%)=载药纳米粒中DOX含量/总DOX含量×100%；载药量(%)=载药纳米粒中DOX含量/载药纳米粒的总量×100%。

图1 新型PEI-PEG修饰的SPION示意图

Fig.1SyntheticschematicofthenewPEG/PEIco-modifiedSPIONs

透射电子显微镜(TEM)对样品的物相结构和微观形态进行表征，马尔文激光粒度仪测量样品的Zeta电位值和水合动力学粒径。

体外药物累计释放度是评价纳米药物载体的重要指标之一，本次实验还检测DOX-SPIONs在不同pH值的PBS缓冲液中(pH值5.0，6.0，7.4)的体外累计释放度。具体方法简述如下：精密称取2 mg的DOX-SPIONs溶解到释放介质4 mL中，然后转移到透析袋中(截留相对分子质量8000)。将透析袋转移到50 mL释放介质中，在37 ℃磁力搅拌条件下进行透析，于不同时间点取袋外透析介质2 mL，同时补充等体积PBS溶液，透析液过孔径0.45 μm微孔滤膜，测定DOX含量，计算累计释放度。

1.5大鼠脑胶质瘤模型的建立及评价 参考文献[5]中大鼠脑胶质瘤建模方法：调整C6细胞数为106·(10 μL)-1，用锥虫蓝排斥实验检测细胞活力>95%。大鼠腹腔注射10%戊巴比妥钠0.5 mL·(100 g)-1麻醉，剪去头顶部毛发，内毗连线与头部矢状中线交汇处纵向1 cm长头皮切口，分离暴露颅骨。于冠状缝与矢状缝交点向前1 mm，右旁开3 mm钻孔，牙科钻外带塑料套管，仅允许钻头钻透颅骨深1.0～1.5 mm，以防止穿透硬脑膜。微量注射器吸入上述细胞悬液10 μL，固定于立体定位仪上，沿钻孔垂直进针深6 mm(距硬脑膜，即大脑右侧纹状体区)，退出1 mm，缓慢注射C6细胞悬液，持针10 min后缓慢拔针，骨孔用无菌骨蜡封闭。术后采用0.9%氯化钠溶液冲洗，切口用线缝合，两针打结，切口消毒。手术均在手术间无菌下操作。手术结束后，由实验动物中心按SPF级分组单笼饲养。

接种后，每日观察荷瘤鼠意识、饮食、睡眠及自主活动等情况。各组大鼠于接种后第8天行在体MRI检测，评价大鼠脑胶质瘤建模效果，同时记录大鼠生存时间，观察偏瘫、衰老和癫等晚期症状。

1.6实验分组及药物干预形式 为了证实在外加磁场的辅助作用下超顺磁性纳米粒作为药物载体递送药物至脑胶质瘤的治疗效果，本实验将上述48只脑胶质瘤SD大鼠随机分为4组，每组12只。对照组：大鼠经尾静脉注射0.9%氯化钠溶液；DOX组：大鼠经尾静脉注射DOX溶液6 mg·kg-1；DOX-SPIONs组：大鼠经尾静脉注射包载DOX的超顺磁性纳米粒溶液6 mg·kg-1；DOX-SPIONs+MF组：大鼠经尾静脉注射包载DOX的超顺磁性纳米粒溶液6 mg·kg-1后外加磁铁，磁铁作用1 h。

给药从造模成功的第9天开始，每周2次(星期一和星期四)，连续给药4周，总共给药8次。具体治疗方法简述如下：脑胶质瘤SD大鼠经腹腔注射10%戊巴比妥钠0.5 mL·(100 g)-1，5 min麻醉后进行实验。将大鼠颅盖骨上的毛发剔去，放置俯卧位。按照上述分组，经尾静脉注射给予相关药物。DOX-SPIONs+MF组大鼠外加磁场干预，将直径2 cm的圆形磁铁固定于脑胶质瘤部位，进行磁靶向引导作用，磁场强度0.3 T，作用时间1 h。

1.6MRI检测各组大鼠脑胶质瘤生长情况 将实验组及对照组大鼠于接种后第8，15，22，29天行MRI检查，确认肿瘤生长情况，确定C6胶质分化程度(WHO分级)和肿瘤界限。MRI常规及增强扫描：经10%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后仰卧位固定。采用成像仪，大鼠扫描专用线圈，尾先进。MRI成像包括横断面及冠状面T1WI、T2WI及增强T1WI检查。为了获得更清晰更直观的增强图像，增强检查经鼠尾静脉注射钆喷替酸葡胺(Gd-DTPA)0.4 mmol·kg-1，10 min后进行。扫描条件：T1WI TR 560 ms，TE 27 ms，激励次数(NEX)2，矩阵256×256；T2WI TR 2300 ms，TE 110 ms，NEX 2，矩阵256×256；扫描层厚2.4 mm，层间距2.9 mm，视野(FOV)56 mm×70 mm，肿瘤体积=(4/3×π×W×H×L)×1/8，单位为mm3。

1.7苏木精-伊红(HE)染色 药物干预结束后，处死大鼠，取脑组织冠状切片，用常规石蜡包埋，行HE染色。将大鼠肿瘤组织经石蜡包埋、切片后，将石蜡切片置于二甲苯中脱蜡15 min，新鲜二甲苯中继续脱蜡15 min，100%乙醇5 min，新鲜100%乙醇5 min，80%乙醇5 min，纯化水5 min，苏木精染色5 min，流水洗去苏木精液3 s，1%盐酸乙醇3 s，水洗30 s，纯化水过洗2 s，0.5%伊红液染色2 min，纯化水洗2 s，80%乙醇稍洗2 s，95%乙醇3 s，新鲜95%乙醇5 s，无水乙醇7 min，石炭酸二甲苯7 min，二甲苯2 min，新鲜二甲苯2 min，再次换新鲜二甲苯2 min，中性树胶封固，显微镜下观察有无组织出血坏死表现。

1.8锥虫蓝染色 石蜡切片常规脱蜡至水，纯化水洗1 min，切片入锥虫蓝染液浸染30 min，纯化水充分冲洗5 min，入伊红染色液，淡染细胞核30 s，自来水冲洗5 s，常规脱水透明，中性树胶封固，显微镜下考察肿瘤部位的铁含量。

1.9TUNEL凋亡染色 将石蜡切片常规脱蜡，在37 ℃下滴加20 μg·mL-1不含DNA的蛋白酶K处理30 min，PBS洗涤3次。避光，加Tunel反应液(酶溶液：标记液=1：9)，37 ℃孵育60 min。用PBS洗涤3次，滴加DAPI染色液，室温孵育10 min。用PBS洗涤3次。抗荧光猝灭剂封片后显微镜下观察各组大鼠肿瘤细胞凋亡情况。

2 结果

2.1DOX-SPIONs的性状表征结果 DOX-SPIONs的透射电镜检测结果见图2。DOX-SPIONs纳米粒分散均匀、形态圆整近似球形，平均粒径约为15.4 nm。该结果证明制备得到的磁性纳米粒粒径小，对称分布，适合作为药物载体。图3为空白及载药磁性纳米粒的磁滞曲线测定结果，磁滞曲线表明，SPIONs和DOX-SPIONs的饱和磁化值分别为45.8 emu·g-1和23.6 emu·g-1，说明本次实验制备的空白及载药磁性纳米粒都具有较好的超顺磁性。同时，马尔文激光粒度仪测定DOX-SPIONs在不同介质中的水合动力学粒径测定结果见图4，载药磁性纳米粒不仅能够长时间稳定分散在PBS溶液中，也可以在生理条件下稳定分散，水合粒径变化较小，进一步说明DOX-SPIONs在近生理条件下是稳定的。

图2 SPIONs纳米粒透射电镜及粒径分布

Fig.2TEMimagesandsizedistributionsoftheSPIONs

图3 空白及载药纳米粒在室温条件下的磁滞曲线

Fig.3MagnetichysteresiscurveofblankandDOX-loadedSPIONsatroomtemperature

图4 DOX-SPIONs在不同介质中的水合粒径

Fig.4Hydrationdiameter(Dh)ofDOXSPIONsafterincubationwithdifferentmedium

紫外分光光度法测定DOX-SPIONs包封率(81.3±1.3)%，载药量(36.3±0.8)%。DOX-SPIONs体外累计释放度测定结果见图5。pH值为5.0，48 h时，DOX从DOX-SPIONs中累计释放量达到90%以上，而pH值为7.4时，累计释放量只有接近25%，说明载药纳米粒具有pH值响应性，能在酸性条件下靶向释药。

2.2大鼠脑胶质瘤模型的MRI评价结果 本研究采用脑立体定位法将C6细胞定量接种在SD大鼠右侧尾状核，建模后8 d行MRI检测。结果见图6。各组大鼠肿瘤细胞接种8 d后可明显观察到大鼠颅内胶质瘤，通过临床诊断手段证明建模方法切实可行，可用于后期的药效评价。

图5 DOX-SPIONs在pH值5.0，6.0，7.4条件体外累计释放度测定结果

Fig.5InvitroreleaseprofilesofDOXfromDOX-SPIONsinmediaofpH5.0.pH6.0andpH7.4

2.3MRI在体测定肿瘤体积及动物生存期监测结果 本次实验通过MRI实时测定各组大鼠肿瘤体积，评价DOX-SPIONs结合外加磁场是对于肿瘤生长的抑制效果，结果见图7，8。结果表明：对照组中，大鼠肿瘤平均体积由第8天(10.12± 6.08) mm3快速增长至第29天(705.75± 86.33) mm3，相对肿瘤体积从第8天的1增长到第29天的(69.78±6.28)(P<0.01)。同时，与第8天比较，第29天时，DOX溶液组，DOX-SPIONs组相对肿瘤体积分别为(60.39±4.43)和(50.46±3.96)(均P<0.01)。DOX-SPIONs+MF组肿瘤体积从第8天(10.35±4.88) mm3增长到第29天(10.18±3.67) mm3，增长倍数为(0.9±1.19)。第29天时，与其他组比较，DOX-SPIONs+MF组大鼠肿瘤体积显著减小(P<0.05)，上述实验结果可以证明，磁场结合DOX-SPIONs可有效抑制脑肿瘤的生长。

中位生存期结果显示，DOX-SPIONs+MF组平均中位生存期为(76.2±1.8) d，对照组为(22.8±2.4) d，DOX溶液组为(38.4±2.1)d，DOX-SPIONs组为(44.8±1.7) d(均P<0.05)。

图6 MRI在体评价大鼠脑胶质瘤建模效果

图7 4组大鼠肿瘤组织MRI成像结果

2.4HE染色结果 HE染色结果表明荷瘤鼠经不同治疗后疗效差异，结果显示对照组，DOX溶液组和DOX-SPIONs组中肿瘤组织存在着过多的细胞，且具有明显的多样性细胞核(图9)。然而，DOX-SPIONs+MF组肿瘤组织中肿瘤细胞明显减少，且表现出明显的细胞凋亡与坏死，此结果表明，DOX-SPIONs结合外磁场可导致肿瘤细胞凋亡，抗肿瘤疗效最显著。

2.5锥虫蓝染色结果 锥虫蓝染色可特异性鉴别组织中的铁，从染色结果显示对照组和DOX组肿瘤部位无蓝色阳性点，DOX-SPIONs组肿瘤部位出现少量蓝色阳性点，而DOX-SPIONs+MF组肿瘤部位出现明显且较多的蓝色阳性点，见图10。该结果证明外磁场可以促进超顺磁性纳米粒在肿瘤部位的聚集，进一步说明超顺磁性纳米粒在外磁场的作用下可以实现靶向递送药物的作用。

2.6TUNEL染色结果 TUNEL染色考察药物干预结束后各组大鼠肿瘤组织中细胞的凋亡情况。结果见图11。图11所示，凋亡细胞核呈绿色，未凋亡肿瘤细胞核呈蓝色。结果表明：相比于DOX-SPIONs组及其他各个药物干预组，DOX-SPIONs+MF组肿瘤细胞凋亡显著增加，说明载药PEG/PEI共修饰新型磁性纳米粒结合外磁场能够显著促进肿瘤细胞凋亡。

图8 4组肿瘤组织体积统计学分析结果

Fig.8Resultsofvolumedetectionoftumorsfromfourgroupsofrats

3 讨论

磁性纳米粒因为具有较强的磁响应性，为肿瘤的靶向治疗提供新选择。

与传统靶向制剂相比，磁靶向制剂具有以下优点：①具有被动靶向和物理靶向双重靶向效果，能够更好地实现靶向给药的目的[6]。②穿越传统药物难以通过的血-脑屏障，提高脑内药物浓度，发挥脑靶向作用，为中枢神经系统及其他脑内用药开辟新途径[7-8]。③载药量高，增加药物的稳定性和生物利用度，延长药物作用时间，减少药物用量。④可与肿瘤热疗联合，达到联合治疗的效果[9]。

本课题创新性地使用PEG/PEI对超顺磁性纳米粒进行修饰以制备具有生物相容性及高载药性的SPIONs，并将其装载经典抗癌药物DOX，对载药的纳米粒进行表征分析，结果证明DOX-SPIONs形态完整、分布均匀，载药量高。同时，药物释放度实验结果证实：新型PEG/PEI在酸性条件下能够加快释药，这可能是因为酸性条件下DOX与有机物分子之间的氢键被破坏，从而使DOX大量释放出来。由于在大多数实体瘤中，肿瘤细胞的胞外pH值均较低，呈酸性环境，因此DOX-SPIONs的这种释药特性特别有利于肿瘤靶向药物递送，促进药物在肿瘤部位靶向释放，减少其毒副作用。同时为了进一步增加DOX-SPIONs的肿瘤靶向特性及血脑屏障穿透能力，课题组还结合外加磁场。通过后期的锥虫蓝染色结果证实应用DOX-SPIONs+MF组干预治疗后大鼠脑内铁含量相比于其他各种干预形式明显增加，说明应用DOX-SPIONs结合外磁场能够更好的实现DOX的靶向药物递送。

另外，通过后期动物实验，课题组还从临床MRI影像学方面和分子病理水平方面对DOX-SPIONs+MF在脑胶质瘤的治疗进行评价。MRI检测及中卫生存期实验结果证实，相比于其他各种形式药物干预治疗，应用外磁场结合新型PEG/PEI修饰超顺磁性纳米粒可以有效携带药物进入肿瘤部位，显著延长荷瘤鼠生存期，抑制肿瘤的生长。同时，与在体影像学评价结果相一致，肿瘤组织HE染色及TUNEL凋亡结果显示：与其他各个治疗组比较，DOX-SPIONs+MF组大鼠29 d后肿瘤区域肿瘤细胞出现大量凋亡、肿瘤细胞显著减少，说明DOX-SPIONs+MF的治疗模式能够显著增加肿瘤靶组织中DOX浓度，发挥其抗脑胶质瘤的效果。这可能是由于pH值响应与磁靶向的双重作用，使得载药纳米粒穿透BBB，在肿瘤区域靶向释药，显著增加肿瘤中DOX浓度，从而实现脑胶质瘤的靶向治疗。

图9 4组大鼠肿瘤组织HE染色(×400，n=6)

图10 4组大鼠肿瘤组织锥虫蓝染色图(×400，n=6)

蓝色：未凋亡细胞核；绿色：凋亡细胞核。

图11 4组大鼠肿瘤组织TUNEL凋亡染色分析(×400，n=6)

Blue: normal cell nuclei, DAPI.Green: apoptosis cell nuclei.

图11TUNELanalysisontumorsfromfourgroupsofrats(×400，n=6)

本次实验开发了一种新型多功能的PEG/PEI共修饰的SPIONs结合外磁场递送传统化疗药物DOX实现胶质瘤的靶向治疗。本研究中制备的SPIONs不仅具有pH值响应性，还能对外部施加的磁场快速响应，从而提高载体携带药物跨血脑屏障至脑胶质瘤部位的效率。该系统显著增强脑胶质瘤中的药物分布，显示出高效的抗肿瘤效果，同时并由于该载体的低毒性，显著延长荷瘤鼠的生存时间，证明功能性的SPIONs可以用作抗肿瘤药物的潜在载体[10]。该方案实现脑胶质瘤的靶向治疗目的，为脑胶质瘤的治疗提供了一条新的思路，并为后期的转化医学应用奠定了基础。