(广西-东盟食品药品安全检验检测中心,广西南宁 530021)

为了预防和治疗禽类各种疾病、促进禽类生长、降低死亡率,兽药被广泛用于禽类及其产品。但由于在兽药使用过程中滥用、误用以及不遵守休药期等现象屡禁不止,造成兽药药物及其代谢产物在禽蛋中残留,超标的现象时有发生,严重影响公众的健康[1-2]。中华人民共和国农业部公告第235号明确规定了食品动物禁用的一系列药物,并制定了这类药物最高残留限量(MRLs)[3],其中激素类、氯霉素类、喹诺酮类、磺胺类、硝基咪唑类、大环内酯类是禁限用药物;喹乙醇代谢物、吩噻嗪类、苯二氮卓类、四环素类、吡啶类、青霉素类、头孢类兽药是禽类常用且容易滥用的药物[4]。因此,建立一种快速、简便、灵敏、可靠、可同时检测食品中多类兽药残留的检测方法十分必要。

液相色谱-串联质谱法因具有高的灵敏度、选择性以及分离能力,已成为同时检测复杂动物组织样品中多类兽药残留极其重要的分析方法[5-6]。但这些方法只能同时检测兽药中的2～4类,同时快速测定上述14类药物在鸡蛋中残留量检测方法报道甚少。在我国农业部235号公告对禽蛋制定的18种残留限量中,仅制定了禽蛋中哌嗪、乐泰菌素、林可霉素、大观霉素4种兽药的检测标准。磺胺类物质按《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20759-2006)检测,而此标准仅适用于牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和兔肉,并未提及禽蛋[7]。《绿色食品 蛋与蛋制品》(NY/T 754-2011)中要求四环素、金霉素和土霉素按《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》(GB/T 21317-2011)测定,而此标准仅适用于动物肌肉、内脏组织、水产品、牛奶,也未提及禽蛋。我国对于禽蛋中兽药残留的检测相关报道甚少,只涉及到氯霉素、甲硝唑、硝基呋喃类和喹诺酮类药物[8-9]。由此可看出我国禽蛋中兽药残留限量标准尚不全面,部分蛋禽养殖过程普遍使用的兽药没有制定残留限量标准,部分兽药残留限量值的设定仍需探究;同时制定残留限量标准的兽药缺乏相应的检测方法[10-11]。因此,开发建立禽蛋中兽药残留的检测方法,考究禽蛋中兽药残留的种类,加强我国禽蛋兽药残留的风险评估,对于食品安全国家标准中兽药最大残留限量及相关检测标准的制修订工作具有重要意义,为食品安全监管工作提供重要的技术支撑[12]。

前处理采用PRiME HLB一步法[13-14]提取和净化鸡蛋样品,前处理简单,并且基质干扰较小、灵敏度较高,能得到较为满意的效果。Oasis PRiME HLB固相小柱是在Oasis HLB固相小柱技术基础上开发的新一代反相固相萃取吸附剂,可以有效地吸附样品中蛋白质和磷脂类物质,较以往固相萃取剂具有更简单、更快速、更洁净的优势[15-16]。因此本研究采用PRiME HLB固相萃取前处理样品,结合液相色谱-串联质谱仪检测,建立了同时测定鸡蛋中磺胺及其增效剂类(10种)、喹诺酮类(9种)、硝基咪唑类(5种)、喹乙醇代谢物(1种)、氯霉素类(3种)、吩噻嗪类(1种)、苯二氮卓类(1种)、大环内酯类(5种)、四环素类(4种)、吡啶类(1种)、青霉素类(4种)、头孢类(2种)、激素类(1种)、抗病毒类(1种)共14类48种兽药残留的新方法,为禽类及其产品中残留兽药的分析提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋 均来自广西多个地市(包括南宁市、桂林市、柳州市、百色市等11个地区)共82批,所有鸡蛋样品均取可食用部分,绞碎均质后,-20 ℃冷冻保存,待检测;磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺地索辛、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、甲氧苄啶、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、洛美沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、达氟沙星、司帕沙星、地美硝唑、甲硝唑、洛硝哒唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑、3-甲基噁喹啉-2-羧酸、氯丙嗪、地西泮、林可霉素、替米考星、红霉素、阿奇霉素、罗红霉素、四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、氯羟吡啶、阿莫西林、氨苄青霉素、苄青霉素、邻氯青霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、地塞米松、金刚烷胺、氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素标准品 纯度均大于90.0%,德国Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈 色谱纯,德国默克公司;乙酸铵 色谱纯,美国Tedia公司;甲酸 分析纯,广东省化学试剂工程技术研究开发中心;所用水 超纯水。

PRime HLB固相萃取小柱(6cc,500 mg)、MCX阳离子交换柱(6cc,150 mg) 美国Waters公司;QTRQ AP4500串联四级杆液质联用仪 美国AB公司;Milli-Q Advantage A10超纯水机 德国Millipore公司;PGC753e型电子天平 艾德姆衡器(武汉)有限公司;Multi Reax型全自动振荡器 Heidolph公司;X3R型高速冷冻离心机 Thermo公司;Genius NM32LA型氮气发生器 PEAK公司;ATR Autovap S60型多样品自动浓缩仪 力德生物科技(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 称取样品约2.50 g(精确到0.01 g)于50 mL聚酯离心管中,用90%乙腈水溶液定容至10.0 mL,剧烈振荡10 min后,10000 r/min冷冻离心5 min。取上清液约5 mL,加入固相小柱内(Oasis PRiME HLB,500 mg,6cc,无需活化),保持1 s/滴,收集流出液到4.0 mL,40 ℃氮吹至小于0.5 mL,用10%乙腈水溶液定容至1.0 mL,涡旋2 min,10000 r/min离心5 min,取上清液,过0.22 μm滤膜,即可[17]。

1.2.2 标准溶液的制备 分别准确称取48种兽药标准物质约10 mg,用乙腈溶解并定容至10 mL,制成1 g/L的单标储备液。分别吸取0.1 mL至同一100 mL容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,制成1 μg/mL的混合标准溶液。

称取2.50 g鸡蛋样品空白基质,分别加入混合标准溶液按1.2.1方法处理样品,制得质量浓度分别为0.5、1、5、10、20、50 μg/kg的基质混合标准工作溶液。以基质混合标准工作溶液中48种兽药的质量浓度为横坐标,对应定量离子的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线[18]。

1.2.3 色谱条件 正离子模式液相色谱条件:色谱柱CAPCELL PAK C18 MGⅢ-H(3 μm,2.0×100 mm),流动相A为0.1%甲酸水、B为0.05%甲酸乙腈。梯度洗脱程序如表1所示,流速0.3 mL/min,进样体积20 μL,色谱柱温度35 ℃。

表1 正离子梯度洗脱程序Table 1 Cation gradient elution procedure

负离子模式液相色谱条件:色谱柱ACQUITY UPLC® BEH C18(1.8 μm,2.1×50 mm),流动相C为5 mmol/L乙酸铵、流动相D为乙腈。梯度洗脱程序如表1所示:正离子的流速0.3 mL/min,进样体积20 μL,色谱柱温度45 ℃。负离子的流速0.3 mL/min,进样体积20 μL,色谱柱温度35 ℃。

表2 负离子梯度洗脱程序Table 2 Anion gradient elution procedure

1.2.4 质谱条件 离子源:电喷雾离子源(ESI),多反应监测(MRM);正离子扫描模式:电喷雾电压(IS)5500 V;离子源温度(TEM)550 ℃;气帘气(CUR)流速35 L/min;雾化气(GS1)流速55 L/min;辅助加热气(GS2)流速55 L/min;射入电压(EP)10 V。负离子扫描模式:电喷雾电压(IS)-4500 V;离子源温度(TEM)550 ℃;气帘气(CUR)流速35 L/min;雾化气(GS1)流速50L/min;辅助加热气(GS2)流速50 L/min;射入电压(EP)-10 V。

1.3 数据处理

使用MultiQuant 3.0.2分析软件对数据进行定量定性分析。

2 结果与分析

2.1 质谱离子源参数的优化

本研究测定的目标化合物种类较多,极性相差大,在质谱中的响应差别也较大,有必要对质谱中信号响应较小的化合物进行离子源参数进行优化。分别选择羟甲基甲硝咪唑、红霉素、甲砜霉素对正、负离子源条件进行优化。将流动相与标准溶液注射泵链接,同时将流动相与标准溶液注入质谱仪中,分别调节质谱的电喷雾电压(IS)、离子源温度(TEM)、气帘气(CUR)流速、雾化气(GS1)流速、辅助加热气(GS2)流速[19-22]。得到化合物响应最大时的离子源条件见1.2.4,48种兽药的相关质谱参数见表3。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择 分别对CAPCELL PAK C18 MGⅢ-H(3 μm,2.0×100 mm)、Waters ACQUITY UPLC® BEH C18(1.7 μm,2.0×150 mm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(1.8 μm,2.1×150 mm)、Phenomenex Kinetex XB-C18(1.7 μm,2.1×100 mm)4种不同型号色谱柱对相同浓度的标准溶液扫描分析,考察其保留时间和分离效果[23-24]。结果发现四根柱子中CAPCELL PAK C18 MGⅢ-H(3 μm,2.0×100 mm)测定正离子项目组分保留时间明显缩短,分离度更好,而ACQUITY UPLC® BEH C18(1.7 μm,2.0×150 mm)测定负离子项目组分的峰型更尖锐,灵敏度更高,因此选用上述两种色谱柱分别对正离子和负离子进行测定。

2.2.2 流动相的选择 在流动相系统选择中,为了使目标物和干扰物达到分离,分别使用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液(负离子)等多种流动相系统进行试验,以采用乙腈-0.1%甲酸水溶液检测正离子质谱的分离度和响应值最高,而采用乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液检测负离子质谱的分离度和响应值较高。所以采用多反应监测模式分开对正、负离子进行测定,使离子对试剂在质谱检测器中响应提高。梯度洗脱时,通过改变流动相的比例,使48种残留药物都分离出来,待测组分保留时间重现性好,灵敏度高。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择 鸡蛋中含有丰富的蛋白质和脂肪,因此在提取过程中,需要考虑沉淀蛋白和去除脂肪[25]。常见的提取剂为乙腈,乙腈同时还具有沉淀蛋白的作用,所以选择乙腈作为提取溶剂[26]。本研究比较了70%乙腈、80%乙腈、90%乙腈、100%乙腈、含1%甲酸乙腈溶液5种溶剂,发现70%乙腈、80%乙腈在过柱时容易堵塞净化柱,可能因为溶剂水分比较高,导致沉淀蛋白和去除脂肪能力减弱,同时水分含量高,在氮吹浓缩步骤时去除水分更为繁琐费时;含1%甲酸乙腈可以较好的沉淀样品中的蛋白质,但对一些碱性化合物如磺胺类回收率偏低;90%乙腈与100%乙腈比较,发现90%乙腈提取回收率较高,峰形较好,故采用90%乙腈进行提取,提取溶剂考察数据对比见图1。

图1 提取溶剂考察数据对比图Fig.1 Comparison of extraction solvent investigation data

表3 48种兽药的质谱参数Table 3 Mass spectrometric parameters of 48 veterinary drugs

2.3.2 固相萃取柱的选择 样品直接提取液含大量杂质如脂肪和磷脂类等物质,所以选择经过固相萃取柱来尽可能净化样品溶液[27],本研究通过对waters HLB固相小柱和MCX阳离子交换固相萃取小柱进行加标回收比较,结果发现,HLB固相萃取过柱时比较容易堵塞净化柱,回收率低,偏差较大,而使用阳离子交换柱的检测响应值明显偏低。PRiME HLB为新型固相HLB处理小柱,属于过滤性除去杂质固相小柱,能有效的去除样品中的蛋白质、磷脂类干扰物质,本研究比较了未使用PRiME HLB净化(图2)和使用PRiME HLB净化(图3)的样品,在母离子质荷比为431和子离子质荷比为184条件下,对磷脂中的主要成分磷脂酰胆碱进行检测,结果表明PRiME HLB小柱能去除大部分的磷脂。选用PRiME HLB前处理过程更加快速、高效、灵敏,能满足鸡蛋中48种药物残留的分析检测要求,所以选用PRiME HLB进行净化[28]。

图2 未使用PRiME HLB净化样品的磷脂酰胆碱离子流图Fig.2 Ion chromatogram of thepurified sample without PRiME HLB

图3 使用PRiME HLB净化后样品磷脂酰胆碱离子流图Fig.3 Ion Chromatogram of thepurified sample using PRiME HLB

2.3.3 定容溶剂的选择 分别用10%乙腈、20%乙腈、30%乙腈、50%乙腈、100%乙腈定容上机考察,实验发现使用100%乙腈、20%、30%、50%乙腈定容时多数目标物的峰型变宽,当用10%乙腈定容时峰型尖锐,因此选择10%乙腈为定容溶剂。

2.4 线性范围、检出限和定量限

按1.2.2配制6个水平的基质匹配混合标准溶液,在选定的色谱条件和质谱参数下进行检测。以目标化合物定量离子的峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X,μg/L)为横坐标绘制工作曲线,48种兽药的线性范围为0.5～50 μg/kg,相关系数r为0.9952～1.0000,线性良好。以定量离子信噪比S/N=3为样品的检出限,S/N=10为定量限,结果见表4。48种兽药的检出限为0.01～0.55 μg/kg,定量限为0.03～1.83 μg/kg。

2.5 回收率和精密度

在优化条件下采用空白鸡蛋基质进行加标回收率及精密度试验,样品添加水平分别为1、5和50 μg/kg,分别对每个添加水平进行平行测试3次,计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)(见表5)。各化合物的回收率为63.3%～111.4%,符合多残留分析的要求。图4、图5为50 μg/kg 添加水平下,鸡蛋中目标化合物的正、负离子流色谱图。

图4 鸡蛋中45种兽药的正离子流图Fig.4 Positive ion flow diagram of 45 veterinary drugs in eggs

图5 鸡蛋中3种兽药的负离子流图Fig.5 Anion flow diagram of three veterinary drugs in eggs

表4 鸡蛋中48种兽药残留的线性方程、相关系数及检出限、定量限Table 4 Linear equation,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of 48 veterinary drug residues in eggs

表5 鸡蛋中48种兽药残留加标回收率及精密度(n=3)Table 5 The adding standard recovery rate and accuracy degree of 48 veterinary drugs in eggs(n=3)

2.6 实际样品测定

采用本研究方法对广西11个地市共82批次鸡蛋进行兽药残留筛查,检出10项目标化合物,针对检出的10种化合物,采用法定标准GB/T 21316-2007、GB/T 21312-2007、GB/T 21318-2007、SN/T 1777.2-2007、GB 29699-2013、SN/T 4253-2015、GB/T 22338-2008对检出项目进行测定,对本研究方法测得结果与标准方法测得结果进行比较,发现本研究方法测得结果与标准方法测得结果基本一致,表明本研究方法数据准确、可靠。结果见表6。

本文采用改进的Oasis PRiME HLB方法,建立了LC-MS/MS同时测定鸡蛋中磺胺类及其增效剂、喹诺酮类、硝基咪唑类、喹乙醇代谢物、氯霉素类等14类48种兽药残留分析方法。与现行国家标准及行业标准相比,本方法可以同时分析多类兽药残留,简单快速,缩短了检验周期,节约了检验的成本。本方法操作简单,净化效果好,灵敏度、准确度和精密度符合多兽残检测技术的要求,为各食品检测机构提供简单快速的方法来应对大批量的鸡蛋样品中禁限用兽药的日常监管,为保证人民饮食安全提供了技术支持。

表6 本方法与标准方法测得值比较Table 6 Comparison of measured valuesbetween the test and the GB method