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(1.安徽省农业科学院茶叶研究所,安徽黄山 245000;2.安徽农业大学,茶树生物学与资源利用国家重点实验室,安徽合肥 230000)

祁门红茶(Keemun black tea)香气独特、滋味醇厚、色泽乌润,尤其是其香气具有浓郁的玫瑰花香、蜜糖香、甜香,被称为“祁门香”。王华夫等研究表明祁门红茶中的香叶醇、苯甲醇、2-苯乙醇等成分含量较高[1]。舒庆玲等[2]研究则表明祁红的特征香气成分是香叶醇、芳樟醇及其氧化物、苯甲醇、苯乙醇、橙花叔醇等芳香物质。另有雷攀登等[3]、宁井铭等[4]研究显示,香叶醇、芳樟醇及其氧化物、苯甲醇、苯甲酸、苯乙醛、2-己烯醛、苯甲醛、水杨酸甲酯等香气成分占到祁门红茶总量的70%～80%,是祁门红茶的主要香气成分,对构成其独特香气品质具有重要的作用。最新研究表明[5],祁门红茶中的香叶醇相对含量(6.89%)显著高于大吉岭红茶(4.28%)、锡兰红茶(0.5%)以及阿萨姆红茶(0.32%),这表明香叶醇对祁门红茶的特征香气具有重要贡献。另外,祁门红茶生化成分研究表明,其水浸出物、茶多酚、氨基酸含量较高,使得茶汤滋味醇厚[3]。

茶叶重要的次级代谢产物主要有多酚类物质、芳香类物质、茶氨酸等,这些次级代谢产物影响着茶叶色泽、香气、滋味等感官品质的形成[6]。祁门红茶为全发酵茶,在加工过程中,多酚类物质发生剧烈氧化,形成茶黄素、茶红素等化合物,是滋味重要组成成分;氨基酸可产生脱氨作用、脱羧作用转化成醇类、醛类、酸类等芳香物质[7]。目前关于多酚类物质代谢途径的研究已经明确非酯型儿茶素、酯型儿茶素形成过程中的关键酶基因[8-9]。萜烯类香气化合物对茶叶香气具有重要贡献,如芳樟醇、香叶醇、橙花醇及橙花叔醇等,是茶叶中重要的香气化合物。王华夫等[1]研究表明福建红茶中的橙花醇含量较高,而云南、广西和广东的红茶则以芳樟醇及其氧化产物含量较高。目前,研究多认为‘祁门香’品质形成具有地域差异,如云南红茶具有特殊的甜香,阿萨姆红茶则具有‘阿萨姆香’[7]。杨停等[10]研究表明不同地域的祁门红茶香气成分在组成及含量上存在一定的差异,但主要香气物质是相似的。

为探究同产区内不同茶树品种对祁门红茶品质形成的差异,本研究选取在祁门红茶产区种植面积较多的2个茶树品种加工成红茶样,其中‘凫早2号’是从祁门群体种中采用单株育种法育成的茶树品种,而‘舒茶早’则是从六安舒城当地群体种中采用单株系统选育法育成[11]。通过高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)及气相色谱-质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)对2个品种红茶的香气成分及滋味物质进行分析,旨在研究品种间红茶品质差异,为后续研究祁门红茶品质形成提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶树(CamelliasinensisL.) 品种为‘凫早2号’、‘舒茶早’,均种植在黄山市安徽省农科院茶叶研究所品种园内,为6年生茶树,其环境气候条件、海拔高度、土壤以及栽培管理水平基本一致。在5月8日采取一芽二三叶用于红茶加工。

GC-MS分析标准品 上海阿拉丁试剂股份有限公司;液相色谱分析标准品 美国Sigma公司;游离氨基酸分析标准品 德国SYKAM公司。50/30 μm CAR/DVB/PDMS萃取头 美国色谱科公司;固样微萃取手柄 美国色谱科公司;DB-5MS石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm) 美国安捷伦公司;Agilent 7890-5975气相色谱质谱联用仪 美国安捷伦公司;C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 日本岛津公司;2010A液相色谱仪 日本岛津公司;SYKAM 433D氨基酸分析仪 德国SYKAM公司。

1.2 实验方法

1.2.1 祁门红茶的加工 茶鲜叶采用传统祁门红茶加工工艺制成红茶样,具体步骤如下:贮青6～8 h;热风萎调4 h;揉捻50 min;25～28 ℃发酵2～3 h;初烘温度100～110 ℃,烘至7成干,摊凉30～40 min;足烘温度80～90 ℃,烘至足干。

1.2.2 感官审评 依据国家茶叶感官审评标准(GB/T 23776-2018),准确称取3 g茶样,加入150 mL沸水,5 min后倒出茶汤,由3位高级评茶员对2个品种红茶样的香气、滋味及汤色进行描述。

1.2.3 GC-MS分析条件 样品处理采用顶空固样微萃取法[12]:准确称取3.0 g红茶样放入250 mL萃取瓶中,加入20 mL沸水,立即密封瓶口,60 ℃平衡5 min后,将萃取头立即插入萃取瓶,与液面维持一定高度,60 ℃水浴萃取30 min,萃取结束后将萃取头插入气相色谱进样口解吸附5 min,每个样品重复3次。气相色谱仪进样口温度为:250 ℃,不分流进样,载气为高纯氦气,纯度为99.99%;柱温程序为40 ℃保持2 min,随后以5 ℃/min升到85 ℃,保持2 min,再以2 ℃/min升到110 ℃,再以7 ℃/min升到139 ℃,最后以5 ℃/min升到230 ℃,保持8 min,分析时间为56 min;质谱接口温度为250 ℃,EI源温度为230 ℃,电子能量为70 Ev,质量扫描范围:35～400 amu。采用面积归一化法计算香气成分的相对百分含量。

1.2.4 液相色谱测量儿茶素、咖啡碱 准确称取1.0 g茶样,加30 mL沸水,90 ℃水浴5 min,重复3次,过滤茶汤,定容至100 mL。上机样品稀释比为:1∶400,用0.45 μm微孔水系滤膜过滤后上机。每个样品重复3次。分析条件为:柱温40 ℃;流动相A为1%乙酸溶液,流动相B为乙腈,流速1.0 mL/min。梯度洗脱条件为B 相在0～20 min由10%线性变化至13%,20～40 min由13% 线性变化至30%,40～41 min由30%线性变化至10%。峰面积为横坐标、浓度为纵坐标做标准曲线,以峰面积求出各组分含量,再换算出茶样中各儿茶素组分的含量[13]。

1.2.5 游离氨基酸的测定 样品处理方法与液相色谱分析方法相同,上机样品稀释比为:1∶200。测定条件:色谱柱为LCA K07/Li,柱温为38～74 ℃梯度升温;流动相A为pH2.9柠檬酸锂溶液,流动相B为pH4.2柠檬酸锂溶液,流动相C为pH8.0柠檬酸锂溶液;洗脱泵流速为0.45 mL/min,衍生泵流速为0.25 mL/min,进样体积为50 μL,分离程序为105 min。以标准品响应面积、含量计算样品游离氨基酸含量[13]。每个样品重复3次。

1.3 数据处理

利用SMICA软件(版本14.1,Umetrics)主成分分析法PCA对两种红茶中的差异化合物进行分析,同时利用SPSS软件(版本19.0)LSD多重比较法分析样品间(n≥3)的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 感官审评

2个茶树品种鲜叶经摊放、萎调、揉捻、发酵、初烘和复烘获得红茶样,后采用国家感官审评标准(GB/T 23776-2018)评价其香气、滋味及汤色。香气审评结果表明,2个品种红茶均具有祁门红茶的甜香特征,但祁门本地褚叶种选育的‘凫早2号’红茶其香气强度高于‘舒茶早’红茶且具有明显的花果香。滋味审评显示,‘舒茶早’红茶具有醇厚特征,滋味鲜爽度高于‘凫早2号’红茶。另外,2个品种红茶的汤色都呈现红明亮特征(表1)。通过感官审评结果可知,同产区内不同茶树品种红茶在香气及滋味品质上有明显差异。

表1 感官审评Table 1 Sensory evaluation

2.2 香气成分分析

为研究2个品种红茶香气差异成因,本研究通过GC-MS技术对红茶中的香气化合物及其相对含量进行检测。结果显示,2个品种红茶样中共分析出42种挥发性香气化合物,其中,烯类化合物8种、醇类化合物10种、醛类化合物11种、烷类化合物4种、酯类化合物6种、酮类化合物2种以及氧杂环化合物1种(表2)。其中,醛类化合物、酮类化合物在2个品种红茶中的相对总量较为一致,而烯类化合物、醇类化合物及酯类化合物的相对总量有明显差异。2个红茶样中相对含量较高的香气化合物较为一致,主要是:2-己烯醛、月桂烯、苯乙醛、芳樟醇及其氧化物、水杨酸甲酯、香叶醇、顺-己酸-3-己烯酯,分别占‘舒茶早’、‘凫早2号’香气总量的83.65%、87.73%,其中‘凫早2号’红茶β-芳樟醇相对含量为33.22%,显著高于‘舒茶早’(P<0.05)。

对2个品种红茶香气化合物进行主成分分析,结果显示,2个品种红茶样组间有明显差异(图1A)。以香气化合物相对含量为变量,获得散点图(图1B),发现影响2个红茶香气品质差异的化合物主要是芳樟醇(C15)、香叶醇(C26)等变异系数较大的化合物。VIP值(Variable Importance Plot)分析结果显示(图1C),VIP值>1的共有10种化合物,其中最可能影响2个红茶香气品质差异的前6种化合物是:芳樟醇(C15)、顺-己酸-3-己烯酯(C31)、香叶醇(C26)、水杨酸甲酯(C21)、苯乙醇(C17)、2-己烯醛(C2)。一般来说,VIP值>1的变量被认为是导致组间差异的代谢物。红茶香气品质取决于多个香气化合物共同作用的结果[14],主成分分析中显示VIP值>1的化合物有10种,这些香气化合物含量的差异都是可能导致两种红茶香气品质差异的原因。尤其是β-芳樟醇,是茶树中重要的萜烯类化合物[15],在两种红茶中的含量变异较大。

图1 两种红茶样中香气化合物主成分分析Fig.1 Principal component analysis ofvolatile compounds in two black teas注:A:主成分分析得分图;B:主成分分析散点图;C:化合物VIP值分析。

2.3 儿茶素类及咖啡碱分析

为研究2个品种红茶滋味差异成因,采用HPLC法分析主要儿茶素类、咖啡碱化合物在2个品种红茶中的含量变化。结果显示,‘舒茶早’、‘凫早2号’红茶中儿茶素总量分别为:11.42、14.48 mg/g。其中,‘凫早2号’红茶中的酯型儿茶素类物质表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量显著高于‘舒茶早’红茶(P<0.05)。另外,咖啡碱含量在‘舒茶早’、‘凫早2号’红茶中的含量也存在显著差异(P<0.05),分别为:36.84、28.60 mg/g(图2)。陈宗道等[16]研究表明咖啡碱是主要苦味物质来源。在涩味物质中,研究显示酯形儿茶素EGCG、ECG和涩度与苦度呈极显著正相关(P<0.01),与甜度呈显著负相关(P<0.05),而简单儿茶素表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)与苦涩度之间无显著相关性[17-18]。由此,推测儿茶素类物质、咖啡碱含量差异是导致‘凫早2号’红茶滋味品质略低于‘舒茶早’红茶的原因。

表2 凫早2号、舒茶早红茶香气成分及相对含量Table 2 List of aroma compounds and relative content in Shu-Cha-Zao and Fuzao NO.2 black tea

图2 2个品种红茶中的儿茶素和咖啡碱含量变化Fig.2 Contents of catechins and caffeine in two black teas

注:不同小写字母表示样品间数据差异显著(P<0.05)。

2.4 游离氨基酸分析

红茶样中含量较高的游离氨基酸主要有茶氨酸、谷氨酸、及天冬酰胺等。由图3可知,除了谷氨酸、苯丙氨酸,其他主要的游离氨基酸在‘舒茶早’红茶中的含量都显著高于‘凫早2号’红茶(P<0.05)。尤其是茶氨酸,它是茶叶中含量最高的游离氨基酸,能够增加茶汤的鲜爽度。祁丹丹[16]研究表明,茶氨酸、谷氨酸含量的减少,会导致茶汤苦味较强。这说明不同类型的氨基酸会呈现不同的味道,其中天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和茶氨酸对鲜味贡献最多[19,20]。‘舒茶早’红茶中天冬氨酸、谷氨酸、茶氨酸含量显著高于‘凫早2号’。因此,较高的咖啡碱、游离氨基酸含量是‘舒茶早’红茶茶汤滋味醇厚度、鲜爽度高于‘凫早2号’红茶的原因。

图3 红茶中游离氨基酸含量Fig.3 Contents of free amino acid in black tea注:L-Theanine:茶氨酸。

3 结论

茶叶香气因不同地区的生态环境及地理状况不同,呈现出不同的品质特征。本研究选取的茶树品种选育地区不同,其遗传背景有差异。试验中,两个茶树品种生长在相同栽培环境下,其生长发育阶段的气候条件、栽培管理较为一致,而结果显示两个品种红茶有不同的风味特征,其中‘凫早2号’红茶香气强度高于‘舒茶早’红茶且香型也略有差异,但其滋味醇厚度、鲜爽度却低于后者。基于试验中鲜叶原料生长状态、加工方式均较一致,这说明遗传背景及内源代谢物的差异是导致两种红茶风味品质不同的主要原因。本研究表明茶树品种对茶叶品质有显著影响,这为后期研究茶叶香气形成及茶树品种的适制性提供了理论依据。