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(1.兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730050;2.河北农业大学农村发展学院,河北保定071000)

黑色食品(Mat Black,MB)主要指天然黑色或颜色较深,营养较丰富平衡并具有一定调节人体生理功能的一类食品[1],MB的营养价值及功能性均高于同类非MB[2],主要分为两类,一类为天然MB,另一类是经加工褐变而成的MB[3],如:黑酱油、豆豉、黑啤酒、黑蒜等。大蒜、豆豉能通过加工能成为MB,其成色机理主要是:加工过程的酶促褐变、美拉德反应,酚类物质的自生缩合、微生物产生黑色素及焦糖化反应形成黑色或褐色的物质,促使原来的食品褐变成MB[4-9]。

柿子具有多种活性成分,营养丰富[10-12]。我国是柿子的主要生产国家,占世界总产量的70%～80%[13]。国内外对柿子的研究及加工除了鲜食,人们主要把它加工成柿子饮料、柿饼、罐头、面包、酱及其它柿子产品等。由于柿子加工的局限性,致使柿子总加工量不到10%,贸易额仅占全球总额3%左右[14-15]。目前,在MB发酵加工中利用的可食安全真菌有黑曲霉Asp.niger、米曲霉Asp.oryzae、毛霉M. sp、根霉R. sp.等,Asp.niger在发酵过程中能产生纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖、氧化酶、果胶酶、没食子酸等,Asp.oryzae发酵过程能产生典型挥发性风味物质、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等,M. sp能产生蛋白酶、脂肪酶等,R. sp.能产生淀粉酶、蛋白酶、果胶酶等[16-17]。

为增加柿子的加工途径,提高柿子的经济价值。本论文根据黑蒜及黑酱油的成色机理,以柿子为颜料,利用微生物能产生多种酶的特点,通过单因素实验和响应面实验来研究磨盘柿发酵黑柿的最佳褐变工艺条件,本文比较4种真菌对发酵柿子褐变程度的影响,通过单因素和响应面实验优化Asp.niger发酵柿子褐变条件,得到影响褐变的显著因素和适宜条件,可为柿子黑色产品开发提供技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

磨盘柿 河北保定茂源果品股份有限公司提供蛋白质含量0.05%、碳水化合物含量17%、水分83.4%、膳食纤维1.4%、灰分2.7%;黑曲霉(Aspergillusniger)、毛霉(Mucorsp.)、根霉(Rhizopussp.)、米曲霉(Aspergillusoryzae) 兰州理工大学生命科学与工程学院实验中心提供;NaOH(AR) 天津益仁达化工有限公司;纯净水 兰州信盈饮品有限公司;PDA培养基 实验室自制。

DHP-9082电热恒温培养箱 上海恒一科学仪器有限公司;BT200微电脑电陶炉 中山奔腾电器有限公司;L550台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器有限公司;752N紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公公司;YX280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司;XH-C快速混合器 江苏省金坛市医疗器械厂;EB-28BI双目光学生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司;LBJ-620 榨汁搅拌机东菀市乐邦电子有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵黑柿子工艺流程 原料筛选→清洗→切块→打浆→分装→灭菌→接种→发酵(指标测定)→黑柿

1.2.2 操作要点 原料筛选:选择表面光滑、无斑、无损伤的柿子作为原料。

原料处理:将挑选的柿子洗净切成约1 cm×1 cm×1 cm大小的块状,打浆(两层纱布过滤),每个玻璃容器中分装500.00 g,用纱布封住口后,0.1～0.15 MPa高压灭菌30 min,取出置于无菌超净台上冷却到室温待用。

菌种活化[18]:将4种真菌以相同的手法接种到新制备的PDA培养基上,于恒温培养箱中32 ℃培养待产孢子时,取出在4 ℃冰箱内保存备用。

菌悬液的制备[19]:将活化好的菌种管用5～10 mL 0.9%无菌氯化钠溶液反复吹洗斜面,将孢子及菌丝转至无菌离心管,4000 r/min离心15 min弃其上清液,取一定质量的沉淀用0.9%氯化钠溶液稀释成1×10-4g/mL的菌悬液。

接种:无菌条件下,取一定量1×10-4g/mL的菌悬液用0.9%氯化钠溶液定容至10 mL加入经处理后的柿子浆中,搅匀后封口,转入一定温度的恒温培养箱中发酵一定时间,3 d翻搅一次,并监测水分使其含量保持在70%～80%范围内。以加入10 mL0.9%无菌氯化钠溶液的柿子浆发酵瓶作对照,以0.9%无菌氯化钠溶液作为空白。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 不同真菌对褐变度的影响 无菌条件下,分别取Asp.niger、M. sp.、Asp.oryzae、R. sp. 10 mL的菌悬液接入分装处理好的柿子浆中,搅拌均匀,封口在32 ℃恒温发酵。经肉眼观察发酵柿子浆褐变程度较大时,分别测定4种真菌对应的发酵物褐变度值,选择褐变度值最大实验组对应的微生物进行后续实验,记录柿子发生明显褐变的时间,为研究发酵时间、温度单因素对柿子褐变的影响做参考。

1.2.3.2 发酵温度对褐变度的影响 无菌条件下,分别向5组处理过的柿子浆瓶中,接入Asp.niger的菌悬液10 mL,搅拌均匀,封口,分别放入22、27、32、37、42 ℃恒环境中恒温发酵36 d,测定褐变度值,筛选出最适发酵温度。

1.2.3.3 发酵时间对褐变度的影响 在无菌条件下,向分装处理好的柿子浆瓶接入Asp.niger的菌悬液放入32 ℃的恒温培养箱中分别培养12、24、36、48、60、72、84、96 d,将筛选得到的微生物菌悬液接入处理过的柿子浆瓶中,最有利发酵褐变的温度条件下恒温发酵,定时翻拌,监测水分含量,每12 d测一个样品的褐变度值,通过比较筛选出最佳发酵时长。

1.2.3.4 加入菌悬液的量对褐变度的影响 分别取Asp.niger的菌悬液2、4、6、8、10 mL,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10 mL的接入分装处理好的柿子浆瓶,充分拌均,定时翻拌,监测水分含量。在温度为32 ℃、发酵72 d,后测定其褐变度值。找出发酵最适Asp.niger接种菌悬液的量。

1.2.4 响应面试验 参照赵自通等[20]人的方法,略作修改:在单因素实验的基础上,利用Design-Expert 11.0.4软件中的Box-Behnken进行三因素三水平试验设计,以Asp.niger的菌悬液的量(6、8、10 mL)、发酵温度(27、32、37 ℃)、发酵时间(60、72、84 d)三个因素为自变量,方案如表1所示。经过试验结果分析,确定因素间的交互作用对柿子褐变的影响,优化柿子褐变条件。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 褐变度的测定 根据果蔬褐变度的测定方法[8,20-21],略作修改:取10.0000 g具有代表性发酵物充分研磨后用15 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液洗入烧杯中,沸水浴5 min,冷却至室温,转入离心机以1000 r/min离心10 min,取其上清液在λ420 nm下的测其吸光值,以A420×10值表示褐变度,褐变度=褐变度实验组-褐变度对照。

1.3 数据处理与分析

每个处理组重复三次,都设有空白对照,数据以平均值表示,采用Origin Pro 2018c软件,Design-Expert 11.0.4软件,Excel 2016软件进行实验数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 4种真菌对柿子褐变度的影响

由图1可知,4种真菌对柿子褐变的影响为:Asp.niger>R. sp.>Asp.oryzae>M. sp.。Asp.niger和R. sp.对柿子褐变影响较大的原因有三种:一是Asp.niger、R. sp.自身可以产生黑色孢子,可以使柿子浆颜色变深[22];二是Asp.niger、R. sp.产生的酶与柿子浆中的小分子物质发生褐变反应;三是Asp.niger和R. sp.自身可以分泌黑色素[23]。从实验目的的角度考虑,选择Asp.niger作为黑柿子发酵真菌。Asp.niger、R. sp.能够分泌糖化酶、果胶酶,可以降解柿子果浆中的果胶、淀粉等大分子物质成为小分子糖类,有利于美拉德反应,所以选择Asp.niger用于后续实验。

图1 4种真菌对柿子褐变度的影响Fig.1 Effects of four fungi on thebrowning degree of persimmon

2.2 发酵温度对柿子褐变度的影响

由图2可以看出,接种Asp.niger对柿子浆在温度为32 ℃时恒温发酵,柿子浆褐变效果最好,可能是因为32 ℃是Asp.niger生长最适宜的温度,发酵温度在22～32 ℃区间,柿子的褐变度随温度的升高而增大,可能是因为22～32 ℃区间,温度是影响Asp.niger生长促进褐变的主要因素;在37～42 ℃时没有22～32 ℃褐变效果佳,但褐变度变化波动不太大,可能是因为温度较高对Asp.niger生长代谢有一定抑制作用,所以32 ℃是发酵的最佳温度,与隋雨菲[24]等人研究发现黑曲霉的生长温度接近。

图2 发酵温度对柿子褐变度的影响Fig.2 Effects of fermentation temperatureon browning degree of persimmon

2.3 发酵时间对柿子褐变度的影响

由图3可知:发酵天数小于72 d时,接种Asp.niger的柿子浆的褐变度逐渐随发酵天数的延长而增加。在72 d后褐变基本保持不变,发酵时长为24～36 d与12～24 d相比褐变度变化较大,可能是因为发酵时长为24～36 d时,柿子浆中的环境最适合Asp.niger生长繁殖,使Asp.niger量达到鼎盛时期;在72 d以后褐变度几乎保持不变,可能是因为微生物生长达到稳定期或衰亡期,发酵时间不是Asp.niger促进柿子浆褐变的主要原因。故发酵时长为72 d是柿子褐变最好的时长。

图3 发酵时间对柿子褐变度的影响Fig.3 Effects of fermentation timeon browning degree of persimmon

2.4 加入菌悬液量对柿子褐变的影响

由图4可知,发酵柿子浆接种Asp.niger菌悬液的量小于6 mL时,柿子的褐变度随菌悬液量的增大而增大,Asp.niger菌悬液的量在2～6 mL范围内,柿子的褐变度随菌悬液量的改变变化较明显,当菌悬液的量大于8 mL时,菌悬液的量增加对柿子褐变度的影响不明显,可能是因为微生物量达到饱和,这时微生物的量不是影响褐变度的主要因素,说明Asp.niger菌悬液的量达到一定限度时,对发酵柿子浆褐变影响不明显。

图4 初始菌悬液量对柿子褐变度的影响Fig.4 Effects of suspension liquid volumes offungi on browning degree of persimmon

2.5 发酵柿子褐变条件响应面优化

2.5.1 Box-Behnken响应面优化实验结果 在单因素实验结果的基础上,利用Design-Expert 11.0.4软件进行Box-Behnken优化,以以Asp.niger的菌悬液的量(6、8、10 mL)、发酵温度(27、32、37 ℃)、发酵时间(60、72、84 d)三个因素为自变量,褐变度为响应值,设计3因素3水平实验,实验设计与结果如表2所示。

表3 Box-Behnken响应面实验结果方差分析表Table 3 Analysis of variance of results of Box-Behnken response surface methodology

注:**代表极显著,P<0.01;*代表显著,P<0.05。

表2 Box-Behnken响应面实验设计与结果Table 2 Experimental design and results ofBox-Behnken response surface methodology

2.5.2 模型的建立与显著性分析 以柿子的褐变度为响应面值,根据表2实验结果,用Design-Expert 11.0.4软件进行多因素回归拟合分析,具体结果如表3。经回归拟合分析后,实验因子Asp.niger菌悬液的量(A)、发酵时间(B)、发酵温度(C)对褐变度(Y)的影响可用以下回归方程表示:

Y=5.56-0.53A+0.23B+0.128C+0.39AB-0.057AC-0.26BC-1.11A2-0.78B2-0.50C2

由表3可知,其F=38.09,P<0.0001,说明本模型拟合程度达到极显著水平;失拟项不显著,其失拟检验的F值为0.49,存在71.07%的失拟,失拟项在α=0.05水平上不显著(P=0.7107>0.05),模型的R2=0.98,说明该模型的可信度较高。在所选各因素的水平范围内,按照对结果的影响排序,Asp.niger菌悬液的量(A)>发酵温度(C)>发酵时间(B)。

从方差分析结果可得,方程的模型A、C、AB、A2、B2、C2对柿子褐变度的影响极显著,B、BC对柿子褐变度的影响显著,AC对柿子褐变度的影响不显著。

2.5.3 响应面交互作用分析 二元拟合模型的响应面分析结果如图5所示,表示用于响应面Asp.niger菌悬液的量(A)、发酵时间(B)、发酵温度(C)3个因子中,当某个因子为固定水平时,另外两个因子对褐变度的协同作用关系,等高线的形状可以直观反应两因子的交互作用强弱和显著程度。由图5可知,菌悬液的量与发酵时间的等高线中心区域呈椭圆形、相对较密集并且曲面较陡峭,说明二者之间交互作用明显;菌悬液的量与发酵时间和发酵温度的等高线图中心区域也构成椭圆,但菌悬液的量与发酵温度构成的曲面相对较平缓、没构成椭圆,说明菌悬液的量与发酵温度的交互作用相对于菌悬液的量与发酵时间要弱;发酵时间与发酵温度构成的曲面相对于菌悬液的量与发酵温度要陡峭,说明发酵时间与发酵温度的交互作用相对于菌悬液的量与发酵温度要明显;此外,菌悬液的量、发酵时间、发酵温度三因子与响应面值褐变度均成抛物线关系,且响应面均为凸面开口向下说明在试验点的连续区域内存在最大值。通过二元拟合求解,预测其最佳褐变工艺条件为Asp.niger菌悬液的量7.51 mL、发酵温度33.49 ℃、发酵时间72.53 d,在此条件下褐变度的理论预测值为5.668。

图5 各因素交互作用对柿子褐变度的影响Fig.5 Effects of interaction of various factorson browning degree of persimmon

2.5.4 验证试验 验证时,为了便于实际操作,对最佳工艺条件预测值修正为黑曲霉Asp.niger菌悬液的量8 mL(1×10-4g/mL)、发酵温度33.5 ℃、发酵时间72.5 d,其他工艺条条件不变,在此条件下进行实际实验操作进3次平行验证试验,褐变度可达到5.62,与理论预测值6.68接近程度高,说明所用二元拟合模型对柿子浆发酵褐变的实验过程具有一定的指导作用。

3 结论

本论文通研究黑曲霉Asp.niger、毛霉M. sp、米曲霉Asp.oryzae、根霉Rhizopussp.这4种真菌接入处理过得柿子浆中发酵加工黑柿子,筛选得到最适宜黑柿产品发酵的微生是黑曲霉Asp.niger,通过考察黑曲霉Asp.niger菌悬液的量、发酵时间、发酵温度等3因子,以褐变度为响应面值建立方程组和模型,预测出最佳发酵条件:黑曲霉Asp.niger菌悬液的量8 mL、温度33.5 ℃、时间72.5 d。在此条件下褐变度可达到5.62,接近了预测值。说明此数学模型对褐变度的预测准确。进一步柿子发酵加工黑色柿子产品和应用提供了一定的参考依据,可为黑色柿子产品开发提供技术借鉴。