张明明,梁美丹,肖 剑,张彬彬,蒋佳希,宋安华

(广州市食品检验所,广东广州 510410)

蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)是芽胞杆菌属的一种兼性需氧、有芽胞、无荚膜、能运动的革兰氏阳性菌,广泛分布于土壤、灰尘和污水中,是食品中常见污染菌和条件致病菌之一[1]。其所致中毒症状主要表现为腹泻和呕吐,引起的食物中毒事件往往比较严重。B.cereus极易污染含蛋白质和碳水化合物丰富的食品,特别是包括米饭、面条和糕点在内的即食米面制品等[2-4]。

近年来,我国各省市地区由蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒事件时有报道。研究发现,在由蜡样芽胞杆菌引发呕吐型食物中毒的食品中,粮食加工品占很大的比例,其中米饭及其制品约占81.1%,面制品约占10.1%,在致泻型食物中毒中粮食加工品占约30%的比例[5]。而即食米面制品因其营养丰富、直接食用等特点,在加工制作、运输、销售过程中更易受病原微生物的污染。由此可见,探究即食米面制品中蜡样芽胞杆菌的污染情况及其毒力基因携带情况与食品安全和消费者的健康息息相关。B.cereus引起的食物中毒与其携带的毒力因子所产生的毒素密切相关。腹泻型毒素是引起腹泻的最主要原因,腹泻型毒素是一种多元化毒素,目前鉴定出与其相关的毒力因子主要包括溶血素BL基因(hbl)、非溶血性肠毒素Nhe基因(nhe)、细胞毒素K基因(cytK)、肠毒素T基因(bceT)和肠毒素FM 基因(entFM)等[6-10]。溶血素BL基因是位于染色体上的一个共转录操纵子,通常由hblA、hblB、hblC、hblD四个基因组成,也有的缺失hblB基因,只由hblA、hblC、hblD三个基因组成。编码非溶血性肠毒素Nhe的三个基因位于质粒上,分别是nheA、nheB、nheC。B.cereus呕吐毒素cereulide是一种环形的小分子肽,抗热性强,对各种物理和化学因素不敏感,一般的食品加工过程无法将其破坏,引发食物中毒,并伴有呕吐症状。目前,针对呕吐型B.cereus毒力基因检测的目标基因有ces、cer和EM1[11-12]。另外,B.cereus的持家基因groEL、gyrB、rpoB、vrrA在所有菌株中均可检出,可用于菌株的辅助鉴定[13-14]。B.cereus引起的食物中毒事件在国内外均有报道,中毒后还可能导致胃肠功能紊乱,各种局部或全身性感染,如坏死性肠炎、肝功能衰竭,菌血症和脑膜炎[15-16]。

本研究以从餐饮服务场所采集了包括盒饭、米饭、粉面、饺子及花卷在内的245份即食米面制品样品,从中分离鉴定得到食源性B.cereus阳性菌株。采用PCR方法对B.cereus阳性菌株的13种毒力基因进行检测,旨在了解该地区即食米面制品中B.cereus的污染状况,探究这些毒力基因在食源性蜡样芽胞杆菌中的分布规律,掌握该地区食源性蜡样芽胞杆菌的流行病学特征,为该病原菌的监控、预警及爆发引起食物中毒后追踪其感染源和传播途径及构建基因指纹图谱库和分子溯源平台提供实验数据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蜡样芽胞杆菌标准菌株CICC 10352 中国工业微生物菌种保藏中心;大肠埃希氏菌ATCC 25922、甘露醇卵黄多黏菌素(MYP)琼脂平板、蜡样芽胞杆菌生化鉴定盒、革兰氏染色试剂盒 广东环凯生物科技有限公司;低熔点琼脂糖 德国SIGMA公司;DL 2000 Marker 宝生物工程(大连)有限公司;GeneGreen核酸染料、2x Taq PCR MasterMix 北京天根生化科技有限公司;PCR引物 华大基因合成。

1300系列A2型超净工作台 Thermo Fisher Scientific公司;SHP-250型培养箱 广东环凯生物科技有限公司;GR85 DR型灭菌锅 ZEALWAY仪器公司;DM2500相差显微镜 Leica仪器有限公司;ME204型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;C1000 Touch PCR仪、水平电泳系统、Gel Doc XR+凝胶成像系统 美国BIO-RAD公司;HNDKT 200-2型恒温金属浴 上海汉诺仪器有限公司;1-14K冷冻离心机 德国SIGMA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 即食米面制品样品的采集 于2016～2018年从广州市市场餐饮服务场所采集不同即食米面制品样品共245份,样品包括:盒饭204份,米饭21份,粉面18份,饺子1份,花卷1份。采集的样品当天送入实验室进行分离培养。

1.2.2 蜡样芽胞杆菌的分离与培养纯化 所有采集样品均在无菌条件下进行处理。按照GB 4789.14-2014《食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》[17]进行检验。

1.2.3 细菌基因组DNA的制备 细菌基因组DNA通过煮沸法制备。煮沸法提取细菌基因组DNA步骤如下:使用1 μL接种环刮取营养琼脂或斜面上培养18～24 h的菌落于200 μL 0.85%灭菌生理盐水中,打散制成菌悬液,13000 r/min离心3 min,弃去上清;加入1 mL灭菌去离子水充分混匀菌体,100 ℃金属浴10 min;冷却后13000 r/min离心3 min,收集上清作为PCR检测模板。

1.2.4 PCR引物 蜡样芽胞杆菌4个持家基因和13个毒力基因的特异引物序列及扩增片段大小见表1。所有文献引用的参考引物均用DNASTAR Lasergene软件进行验证。

表1 蜡样芽胞杆菌持家基因及毒力基因检测引物Table 1 Primers for detection of virulence genes and house-keeping genes in B.cereus

1.2.5 蜡样芽胞杆菌携带持家基因和毒力基因的检测 利用蜡样芽胞杆菌不同持家基因及毒力基因引物进行PCR 扩增。

反应体系:总体积为25 μL,2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,超纯水8.5 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,菌株DNA模板2 μL,空白对照组用无菌超纯水补足至25 μL。

PCR反应程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,不同退火温度30 s,72 ℃ 1 min,30个循环,72 ℃ 10 min。以0.5×TBE为电泳缓冲液,在100 V电压下对PCR 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,并利用凝胶成像系统检测。

1.3 数据处理

数据处理及分析采用SPSS 15.0软件。

2 结果与分析

2.1 即食米面制品中蜡样芽胞杆菌的分离与初步鉴定

由于蜡样芽胞杆菌不能利用D-甘露醇不产酸,在MYP选择培养基酚红指示剂作用下,菌落形态为典型的粉红色。蜡样芽胞杆菌产生卵磷脂酶,在MYP培养基中卵黄乳液作用下,会在菌落周围产生2～5 mm沉淀环,菌落较大,表面比较干燥。通过生化鉴定、根状生长试验和蛋白质毒素结晶试验判定蜡样芽胞杆菌阴阳性。本研究245份即食米面制品样品中检出26份样品蜡样芽胞杆菌呈阳性,检出率为10.61%(26/245),阳性检出样品主要为盒饭及米饭,在粉面中仅检出阳性样品1份,饺子及花卷中未出现阳性样品。阳性样品中蜡样芽胞杆菌平均检出量为3032 CFU/g,详见表2。由表2可以看出,几种不同类型的即食米面制品样品中盒饭的阳性率10.29%基本与样品总体阳性率10.61%持平,其蜡样芽胞杆菌的平均检出量4010 CFU/g,明显高于其他几类样品,且其最大检出量41000 CFU/g已接近于可能引发食物中毒的105CFU/g蜡样芽胞杆菌含量。

2.2 蜡样芽胞杆菌持家基因及毒力基因鉴定

对分离得到的蜡样芽胞杆菌阳性菌株进行4个持家基因groEL、rpoB、gyrB、VrrA的检测,结果表明阳性分离菌株的4个持家基因检出率均为100%,进一步确认阳性分离菌株为蜡样芽胞杆菌。部分蜡样芽胞杆菌分离菌株4个持家基因的PCR产物电泳图见图1。

表2 即食米面制品中蜡样芽胞杆菌检出状况Table 2 Detection level of B.cereus in ready-to-eat products of rice and wheat

图1 部分蜡样芽胞杆菌分离菌株持家基因PCR产物电泳图Fig.1 The electropherograms of PCR products ofhouse-keeping genes form parts of B.cereus isolates注:M:DL 2000 Marker;1:试剂空白;2:提取空白;3:阳性对照(蜡样芽胞杆菌CICC 10352);4:阴性对照(大肠埃希氏菌ATCC 25922);5～9:蜡样芽胞杆菌分离菌株BC-1～BC-5;A～D:groEL、rpoB、gyrB、VrrA基因图谱。

结果表明从26份阳性样品中共筛选得到49株蜡样芽胞杆菌菌株。对这49株阳性菌株进行毒力基因检测,结果详见表3。由表3可知,49株阳性分离菌株均检出两种或者两种以上的毒力基因,即分离菌株的毒力基因携带率为100%,且均为复合型毒素携带菌株。菌株BC-36携带的毒力基因数量最少,为2种(nheB和nheC),阳性菌株中共有6株检出最高的毒力基因携带数量9种,检出携带4种毒力基因的菌株数量占所有阳性菌株的比例最高,为22.45%(11/49)。在检测的10种腹泻型毒力基因中,非溶血性肠毒素基nheB和nheC的检出率最高,均达到95.92%(47/49),其次为肠毒素基因entFM和nheA,检出率分别为91.84%(45/49)和73.47%(36/49),4个溶血素BL基因检出率分别为hblA20.41%(10/49)、hblB8.16%(4/49)、hblC38.78%(19/49)和hblD40.82%(20/49),肠毒素基因becT和细胞毒素基因cytK的检出率分别为30.61%(15/49)和40.82%(20/49)。三种呕吐型毒力基因ces、cer、EM1检出率较低,均为4.08%(2/49),仅有菌株BC-37及BC-43检出,检出的这2株阳性菌株均含有这三种毒力基因。经过阳性对照实验发现,参考菌株CICC 10352中检测出nheA、nheB、nheC、entFM基因和四个持家基因。

表3 蜡样芽胞杆菌分离菌株毒力基因分布Table 3 The distribution of virulence genes of isolated B.cereus

续表

注:“+”表示检出阳性,“-”表示检出阴性;表格栏“来源”命名规则为“样品类型-年份-编号”,“HF”代表盒饭样品,“FM”代表粉面制品样品,“MF”代表米饭样品;如“HF-18-1”代表阳性菌株BC-1来源于2018年采集的盒饭样品01号。

从表3显示的数据进一步分析发现蜡样芽胞杆菌毒力基因携带模式共有26 种,说明即使米面制品中分离的蜡样芽胞杆菌呈现遗传多样性。其中44.90%(22/49)的蜡样芽胞杆菌携带hbl基因,同时携带hblA、hblC和hblD的蜡样芽胞杆菌共有9株,其中同时携带hbl4个基因的菌株共有4株,说明hblB基因存在着部分缺失。检测发现所有的阳性菌株均携带nhe基因,nheB和nheC均具有最高的检出率95.92%,nheA检出率(73.47%)略低于前二者,71.43%(35/49)的蜡样芽胞杆菌同时携带nheA、nheB和nheC。91.84%(45/49)的蜡样芽胞杆菌同时携带nhe和entFM基因,检出率相对较高,说明非溶血性肠毒素nhe基因、entFM基因是分离菌株的主要毒力基因。既携带nhe3个基因同时又携带hblA、hblC和hblD基因的菌株有7株,占14.29%(7/49),且这7株菌均含有entFM基因,属强毒株。呕吐型毒力基因ces、cer、EM1仅在菌株BC-37及BC-43中检出,其检出率(4.08%)远低于腹泻型毒力基因;检出的这2株阳性菌株均含有这三种毒力基因,同时携带nheC及entFM。针对于nheB基因的检测发现,除去检出呕吐型毒力基因ces、cer、EM1的菌株BC-43及BC-49之外的其他阳性菌株均检出nheB阳性。

从样品来源分析,有多种不同毒力基因携带模式的蜡样芽胞杆菌分离自同一样品:携带四种不同毒力基因型的阳性菌株BC-4、BC-5、BC-6及BC-7均分离纯化自样品“HF-17-2”,说明蜡样芽胞杆菌遗传存在多样性。同一份样品中存在着多种毒力基因型的菌株说明样品来源环境较为复杂,相较于米饭、饺子等无需多次混装的样品,盒饭由于其米饭、菜等多次混装的过程增加了其蜡样芽胞杆菌污染的风险。比较于米饭、粉面等样品检出的毒力基因型,由盒饭检出的毒力基因型种类明显较多。

3 结论和讨论

本研究从餐饮服务场所采集包括米饭、粉面、饺子及花卷在内的245份即食米面制品,蜡样芽胞杆菌的检出率为10.61%(26/245),阳性检出样品主要为盒饭及米饭,在粉面中仅检出阳性样品1份,饺子及花卷中未出现阳性样品。阳性样品中蜡样芽胞杆菌平均检出量为3032 CFU/g,其中以盒饭的检出程度最高。从即食米面制品中分离得到的蜡样芽胞杆菌菌株携带的13种毒力基因进行调查,每株均检出两种或两种以上的毒力基因,发现腹泻型毒力基因nhe和entFM为主要毒力基因。

本研究中蜡样芽胞杆菌的检出率与刘勋等[21]对郴州市餐饮服务环节和流通环节即食食品食源性致病菌污染状况调查中熟制米面制品蜡样芽胞杆菌的检出率16.33%、倪刚等[22]在对红河州食源性蜡样芽胞杆菌研究中发现米面制品中蜡样芽胞杆菌的检出率为13.5%比较接近。在多起蜡样芽胞杆菌食物中毒事件中,被污染的食品主要为剩米饭(44.6%)和开水泡饭(17.0%)[23]。我国相关食品的标准中没有明确蜡样芽胞杆菌的残留限量规定值,对该菌的要求大多是按照进食污染菌量>105CFU/g的食物时就可能发生食物中毒[24]的标准进行检验控制。但是在夏季,米饭和凉拌食品如凉面、凉皮等原料本身容易被蜡样芽胞杆菌污染。王彤等[25]的研究表明温度对蜡样芽胞杆菌含量及毒素的产生有直接的相关性,在一定范围内的高温环境中,温度越高引起食物中毒的风险越大,应当给予重视。本研究中盒饭及米饭中的蜡样芽胞杆菌检出率较高;与米饭相比,盒饭中蜡样芽胞杆菌的平均检出量高出一个数量级,且其检出范围更宽,最大检出量接近于可能引发食物中毒的105CFU/g含量值,这可能与盒饭的制作过程先处理再多次混装有关,多次混装的过程增加了蜡样芽胞杆菌等致病菌对食品的污染风险。由此可知,需加强对以盒饭为主要经营方式的快餐店,尤其是网络快餐店的食品安全风险监测。

蜡样芽胞杆菌的致病性与其携带的毒力基因直接相关,了解食源性蜡样芽胞杆菌主要毒力基因型,有助于掌握食源性蜡样芽胞杆菌的流行病学特征。对分离的49株蜡样芽胞杆菌所携带的毒力基因进行检测发现,仅菌株BC-37及BC-43中检出呕吐型毒力基因ces、cer、EM1,检出率(4.08%)较低,与Kim等[26]及Wijnands等[27]的研究结果基本一致。所有分离的蜡样芽胞杆菌中44.90%(22/49)菌株携带hbl基因,同时携带hblA、hblC和hblD的蜡样芽胞杆菌共有9株,有研究[28]表明只有当菌株含有hblA、hblC、hblD全部三个毒力基因时,该菌株才会产生溶血毒素BL,说明这9株蜡样芽胞杆菌是可以产生溶血毒素BL,对消费者会产生危害。此外,检测发现所有的阳性菌株均携带非溶血肠毒素nhe基因,其中35株蜡样芽胞杆菌同时携带nheA、nheB和nheC,表明分离到的所有蜡样芽胞杆菌中有71.43%(35/49)的菌株能够发挥非溶血性肠毒素的强致腹泻功能。91.84%(45/49)的蜡样芽胞杆菌同时携带nhe和entFM基因,检出率相对较高,说明非溶血性肠毒素nhe基因、entFM基因是分离菌株的主要毒素基因,与李文涓等[29]、章乐怡等[30]等研究结果一致。既携带nhe3个基因又携带hblA、hblC和hblD基因的菌株有7株,占14.3%(7/49),且这7株菌均含有entFM基因,属强毒株。如果消费者不小心摄入了被上述蜡样芽胞杆菌污染的食品,引起食物中毒的风险较大,且产生腹泻等不良反应的可能性高于呕吐等不良反应。但是Cai等[31]等在对蜡样芽胞杆菌基因组及基因多样性分析时发现由nheA、nheB和nheC转录翻译的NHE蛋白并未参与形成腹泻症状,这有待进一步的研究证实。通过本研究获得的结果对该病原菌的监控、预警及爆发引起食物中毒后追踪其感染源和传播途径及构建基因指纹图谱库和分子溯源平台具有指导意义。