刘 娜,安晓萍,张倩茹,王 园,王瑞芳,齐景伟

(内蒙古农业大学动物科学学院,内蒙古呼和浩特 010018)

腐植酸是一类广泛存在于自然界中的结构功能十分复杂的化合物[1],常以钠盐形式存在,极易溶于水,具有弱酸性、络合性、胶体性和吸附性等特性[2]。腐植酸类物质是多功能的高分子化合物,具有很大的内表面积,吸附、交换、络合和螯合的能力较强,多在农业上作为农药、肥料、土壤改良剂等使用。腐植酸在动物生产上具有提高动物免疫力、抗病力,保护动物胃肠道功能,吸附霉菌毒素、促进瘤胃氮循环、提高尿素利用率,减轻动物粪便等生物学功能,在单胃动物和反刍动物生产中有一定的应用[3]。腐植酸钠具有抗菌、抗炎和抗病毒等作用,有相关研究报道其具有促进益生菌生长,抑制有害菌繁殖的作用[4-7],但近几年腐植酸钠作用于微生物领域的研究鲜有报道。

植物乳杆菌作为大规模工业生产的发酵菌株,常见于许多蔬菜、牛奶和肉类等发酵制品中,能通过胃定植于肠道中发挥重要作用[8]。植物乳杆菌在肠黏膜的黏附是其在机体内定植并产生生物屏障作用的第一步,具有抑制病原菌入侵和增殖等重要生理功能,因此黏附能力是评价植物乳杆菌定植形成稳定的菌群发挥益生作用的重要指标之一。黏附能力又与菌株的凝集能力和表面疏水性有关。表面疏水性是通过测定菌体细胞表面的物化性质来间接反映其黏附性强弱的。菌株的凝集包括自凝集和与致病菌的共凝集,分别指同一菌株之间的凝集现象及不同菌株之间的凝集现象。研究证明,具有较强凝集能力的菌株可能具有更强的肠道定殖能力和抑制病原菌的能力[9]。

腐植酸钠来源天然,无污染、无残留,无毒副作用,应用前景广阔。但近几年在微生物发酵领域研究较少,尤其是腐植酸钠对益生菌的抑菌和黏附作用研究鲜有报道。因此,本实验在液体培养基中添加不同浓度的腐植酸钠,首次研究其对植物乳杆菌的抑菌率、自凝集率、与大肠杆菌的共凝集率和表面疏水性的影响,为腐植酸钠在益生菌发酵领域中的应用提供理论依据,并对腐植酸钠作用于益生菌开发功能性食品或饲料添加剂奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌P8(LactobacillusplantarumP8) 由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室保存并提供,大肠杆菌A2分离于羔羊肠道内,由内蒙古自治区草食家畜饲料工程技术研究中心保存提供;腐植酸钠 天津市光复精细化工研究所;高碘酸钠、氯化锂、甲醇 均为分析纯;MRS液体培养基、022010营养肉汤培养基 广东环凯微生物科技有限公司。

JJ-CJ-1F超净工作台 苏州市金净净化设备科技有限公司;TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;SYQ-DSX-28OB手提式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械广;CP224C电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司;GX2智力光照培养箱 宁波东南仪器有限公司;Epoch2酶标仪 雷康恒泰(北京)商贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 种子液的制备和菌数的调整 将-20 ℃冷冻保存的植物乳杆菌P8菌种接种于MRS斜面培养基中,37 ℃静置培养48 h,待形成菌落后挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中,37 ℃静置培养24 h,即得P8种子液。将-20 ℃冷冻保存的大肠杆菌A2菌种接种于营养肉汤斜面培养基中,36 ℃静置培养48 h,待形成菌落后挑取单个菌落接种于营养肉汤液体培养基,置于摇床中36 ℃,120 r/min培养24 h,即得A2种子液。

使用平板计数法得出P8种子液中的菌落数为4×109cfu/mL,A2种子液中菌落数为1×109cfu/mL。将P8和A2菌落数均调整为108cfu/mL进行下面实验。

1.2.2 不同浓度腐植酸钠溶液的配制 准确称取0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 g的腐植酸钠,分别放入99.5、99.0、98.0、96.0和92.0 mL灭菌的MRS液体培养基中,搅拌均匀,使腐植酸钠充分溶解,过滤,去掉滤渣,得到添加0%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%和8.0%(m/v)腐植酸钠的MRS液体培养基。

1.2.3 腐植酸钠对植物乳杆菌生长曲线的影响 在添加不同浓度腐植酸钠的MRS液体培养基中分别接种5%的P8种子液,静置培养48 h,每4 h测定其600 nm下的OD值。以培养时间为横坐标,对应点的OD值为纵坐标,绘制出各组植物乳杆菌的生长曲线。以不添加腐植酸钠组作为对照组,对比添加不同浓度腐植酸钠对植物乳杆菌生长曲线的影响。

1.2.4 腐植酸钠对植物乳杆菌抑菌能力的影响 在添加不同浓度腐植酸钠的MRS液体培养基中分别接种5%的P8种子液,静置培养24 h。分别吸取培养好的P8菌液和A2菌液各10 mL,以5000 r/min的速度离心10 min,取上清液待用。取96孔板,每孔分别加入100 μL P8上清液和100 μL相同浓度的A2上清液,置于37 ℃恒温箱中培养24 h,分别在0和24 h测定其在600 nm下的吸光光度值。抑菌率计算公式如下:

式(1)

式中:B0为初始时间时600 nm下的吸光光度值;B1为24 h时 600 nm下的吸光光度值。

1.2.5 腐植酸钠对植物乳杆菌凝集能力的影响

1.2.5.1 自凝集能力的影响 在添加不同浓度腐植酸钠的MRS液体培养基中分别接种5%的P8种子液,静置培养24 h。以5000 r/min的速度离心10 min后收集菌体,使用pH为7.2的PBS洗涤2次后于PBS中重悬,调整菌数为108cfu/mL。取5 mL等量的细胞菌悬液装入离心管中,混匀后在室温下静置。在0、2、4、6和8 h分别取0.5 mL上部菌悬液,加到1.5 mL的PBS中,混匀后测定该菌悬液在600 nm下的吸光值,以PBS缓冲液为空白对照。凝集率的计算公式如下[10]:

式(2)

式中:A0为0 h测定的600 nm下的吸光光度值;At为不同时间在600 nm的吸光光度值。

1.2.5.2 与大肠杆菌共聚集能力的影响 P8菌悬液的制备同1.2.5.1,A2采用同样的方法,重悬于PBS中,调整菌数为108cfu/mL。分别吸取3 mL P8菌悬液和A2菌悬液于试管中,漩涡混合30 s,分别于 0、2、4、6、8 h吸取上部菌悬液测定其在600 nm下的吸光值[11]。对A2的凝集率计算公式如下:

式(3)

式中:A0为P8和A2混合0 h时在600 nm下测定的吸光光度值;At为混合液在不同时间的吸光光度值。

1.2.6 腐植酸钠对植物乳杆菌表面疏水能力的影响 表面疏水性能的测定采用微生物黏附碳氢化合物法(BacteriaAdhesion To Hydrocarbons,BATH)[12]。P8菌悬液的制备同1.2.5.1,分别吸取6 mL P8菌悬液与1 mL二甲苯涡旋混合60 s,停顿10 s,再涡旋混合60 s,室温下静置60 min分层。取下层水相,测定其在600 nm下的吸光值,以PBS缓冲液为空白对照。表面疏水率计算公式如下:

式(4)

式中:H0为与二甲苯混合前600 nm下的吸光光度值;H1为与二甲苯混合后600 nm的吸光光度值。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次,实验结果以运用SAS 9.2软件,采用方差分析(ANOVA)并用Duncan’s方法对各组间平均数进行多重比较,P<0.05为差异显著,采用Excel对数据进行整理并绘图。

2 结果与分析

2.1 腐植酸钠对植物乳杆菌生长曲线的影响

由图1可知,随着培养时间的延长,各组间菌体数量呈现先增加后降低的趋势。在0～20 h之间,各时间点的OD值较为接近;在24～48 h之间,各时间点的OD值有一定差别,总体趋势上是0.5%腐植酸钠组>对照组>1%组>2%～8%组。虽然在24～48 h腐植酸钠0.5%组吸光度值高于对照组,但差异不显著。

图1 腐植酸钠对植物乳杆菌生长曲线的影响Fig.1 Effects of sodium humate on thegrowth of Lactobacillus plantarum

2.2 腐植酸钠对植物乳杆菌抑菌作用的影响

腐植酸钠对植物乳杆菌抑菌作用的影响见图2。由图2可知,各组的植物乳杆菌上清液对大肠杆菌均有抑制作用。添加0.5%～1.0%腐植酸钠组的抑菌率显著高于对照组(P<0.05),而添加2%～8%腐植酸钠组抑菌率显著(P<0.05)低于对照组。添加0.5%和1.0%腐植酸钠组的抑菌率分别为26.10%和39.10%,比对照组的21.9%提高了19.18%和75.53%。说明添加0.5%～1.0%腐植酸钠可使植物乳杆菌的抑菌率提高19.18%～75.53%。

图2 腐植酸钠对植物乳杆菌抑菌率的影响Fig.2 Effect of sodium humate on theantibacterial rate of Lactobacillus plantarum注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05);图4～图7同。

图3 腐植酸钠对植物乳杆菌自凝集率的影响Fig.3 Effects of sodium humate on theauto-aggregation of Lactobacillus plantarum注:相同添加量不同字母表示差异显著,P<0.05;相同添加量相同字母表示差异不显著,P>0.05。

2.3 腐植酸钠对植物乳杆菌凝集能力的影响

2.3.1 腐植酸钠对植物乳杆菌自凝能力的影响 图3为腐植酸钠对植物乳杆菌自凝能力的影响。各组的自凝集率随着时间的增加呈现出不同的规律。对照组的自凝率随着时间的增加而增加,在8 h时最高,为61.01%;腐植酸钠0.5%～8.0%组的自凝率则先增加后降低,其中,0.5%～1.0%组在4 h时自凝集率最高,分别为44.84%和48.51%,而2%～8%组的自凝集率在6 h最高,分别为63.45%和66.77%。说明添加0.5%～8.0%腐植酸钠能使植物乳杆菌的自凝集率提前2～4 h达到最高。

进一步对比不同时间点腐植酸钠对植物乳杆菌自凝集率的影响。由图4可知,在2 h时,添加4%～8%腐植酸钠可显著提高植物乳杆菌的自凝集率(P<0.05),比对照组提高45.21%～95.98%;在4 h时,添加4%～8%腐植酸钠可显著提高植物乳杆菌的自凝集率(P<0.05),比对照组提高16.89%～22%;在6 h时,添加4%～8%腐植酸钠可显著提高植物乳杆菌的自凝集率(P<0.05),比对照组提高28.81%～35.55%;在8 h时,添加4%～8%腐植酸钠与对照组的自凝集率差异不显著(P>0.05),而0.5%～2.0%腐植酸钠组的自凝集率则显著低于对照组(P<0.05)。结合图3和图4可知,添加4%～8%腐植酸钠在2～6 h可显著提高植物乳杆菌的自凝集率(P<0.05)。

图4 不同时间点腐植酸钠对植物乳杆菌自凝集率的影响.Fig.4 Effects of sodium humate on the auto-aggregation of Lactobacillus plantarumat different points in time注:(1)～(4)分别为2、4、6、8 h;图6同。

2.3.2 腐植酸钠对植物乳杆菌与大肠杆菌共聚能力的影响 图5为腐植酸钠对植物乳杆菌与大肠杆菌共凝集能力的影响。由图5可知,在静置凝集的8 h过程中,各组的凝集率均随时间的延长而升高,在8 h达到最大。不同时间点各组的差异见图6。由图6可知,在2 h时,添加4%～8%腐植酸钠组植物乳杆菌与大肠杆菌的共凝集率显著高于对照组(P<0.05),0.5%～1.0%组则显著低于对照组(P<0.05),2.0%添加量组与对照组差异不显著(P>0.05);在4 h时,添加0.5%～8%腐植酸钠可显著提高植物乳杆菌的自凝集率(P<0.05);在6 h时,添加1%～8%腐植酸钠组的共凝集率显著高于对照组(P<0.05);在8 h时,添加0.5%～4.0%腐植酸钠组的共凝集率显著高于对照组(P>0.05)。说明添加不同浓度的腐植酸钠在不同时间点对植物乳杆菌与大肠杆菌的共凝集率由不同的影响。结合图5和图6可得,添加4%～8%腐植酸钠在2～6 h可提高植物乳杆菌与大肠杆菌的共凝集率,说明添加一定浓度的腐植酸钠具有促进液态基质中植物乳杆菌与致病菌聚集的能力。

图5 腐植酸钠对植物乳杆菌与大肠杆菌共凝集能力的影响Fig.5 Effects of sodium humate on the co-agglutinationrate with Escherichia coli of Lactobacillus plantarum

2.4 腐植酸钠对植物乳杆菌表面疏水能力的影响

由图7可知,添加2%～4%腐植酸钠组的表面疏水率显著高于对照组(P<0.05),较对照组提高了112.5%～128.57%;添加0.5%组的表面疏水率显著(P<0.05)低于腐植酸钠组,添加1%和8%组的表面疏水率与对照组差异不显著(P>0.05)。说明添加2%～4%腐植酸钠可使植物乳杆菌的表面疏水率提高112.5%～128.57%。

图7 腐植酸钠对植物乳杆菌表面疏水能力的影响Fig.7 Effects of sodium humate on thesurface hydrophobicity of Lactobacillus plantarum

3 讨论

生长曲线直观地显示了细菌在培养过程中所表现出来的生长规律。同一种细菌在不同的培养条件下,其生长曲线和菌体活力不同[13]。本试验中,添加不同浓度的腐植酸钠对植物乳杆菌生长产生了一定的影响,但差异不显著。原因可能是在液体培养过程中,不同浓度腐植酸钠的胶体特性和吸附能力不同,对植物乳杆菌的吸光度值产生了影响。该结果还需进一步采用活菌计数的方法进行验证。

图6 不同时间点腐植酸钠对植物乳杆菌与大肠杆菌共凝集率的影响Fig.6 Effects of sodium humate on the co-agglutination rate with Escherichia coli of Lactobacillus plantarumat different points in time

添加0.5%～1.0%腐植酸钠可使植物乳杆菌的抑菌率提高19.18%～75.53%。其中1.0%的添加量抑菌效果最好。可能是由于腐植酸钠提高了植物乳杆菌的自凝集能力和与大肠杆菌的共凝集能力。自凝集能力提高可能使植物乳杆菌定殖能力更好,而共聚能力提高可能掩盖大肠杆菌的表面物质,使大肠杆菌不能特异性的与宿主细胞表面分子受体结合,从而达到抑制大肠杆菌的作用[14]。

大量研究发现,乳酸菌的黏附能力与其自凝集能力和表面疏水性相关,具有较强的自凝集能力和表面疏水性的菌株具有更高的黏附能力,反之则黏附能力较低[14,10]。乳酸菌的凝集能力与病原菌共凝集的能力和其黏附宿主细胞的能力具有相关性,凝集能力较强的菌株可能定殖能力更好,可以更有效借助共凝集能力清除致病菌[15]。本实验发现添加4.0%～8.0%腐植酸钠在2～6 h可显著提高植物乳杆菌的自凝集率和与大肠杆菌的共聚集率。菌体的自聚集能力可促进其生物膜的形成,使菌体在肠道内提前占位,进而抑制病原菌的入侵[16]。菌株的表面疏水性是评价细菌黏附性的重要指标[17]。通过测定腐植酸钠对植物乳杆菌表面疏水率的影响,得到了添加2.0%～4.0%腐植酸钠可使植物乳杆菌的表面疏水性提高112.5%～128.57%的结果。说明了添加一定浓度的腐植酸钠可以提高植物乳杆菌的黏附能力。

4 结论

添加0.5%～1.0%腐植酸钠可使植物乳杆菌的抑菌率提高19.18%～75.53%;添加4%～8%腐植酸钠在2～6 h可以提高植物乳杆菌的自凝集率和与大肠杆菌的共聚集率。添加2%～4%腐植酸钠可使植物乳杆菌的表面疏水率提高112.5%～128.57%。综上所述,选择合适浓度的腐植酸钠可提高植物乳杆菌的抑菌和黏附能力。本研究可为腐植酸钠在益生菌发酵领域的应用提供理论依据,并对利用腐植酸钠作用于益生菌开发功能性食品或饲料添加剂奠定了基础。