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(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;2.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京 210014)

阴沟肠杆菌是一种革兰氏阴性短杆菌,广泛存在于环境和动物肠道中的条件致病菌,同时也是肉制品中的一种主要腐败菌,同肉制品中分离得到的多数腐败菌相比,该菌具有很强的生物膜形成能力[1-2]。自1978年Costerton首先发现并提出了生物膜(biofilm)理论以来[3]。研究发现引起人类、畜禽疾病的许多细菌都可以形成生物膜[4-5],在食品加工生产中,多数食源性致病菌可以在不同的加工材料表面形成生物膜,以生物膜形式存在的致病菌,耐受性更强,在加工过程中固着在加工设备表面成为潜在的污染源[6-9],中国食源性疾病监测网的调查结果显示,27%微生物污染来自于食品加工设备等造成的交叉污染,是最主要的污染途径[10]。林学海[11]等对婴幼儿食品生产环境中可能存在的阴沟肠杆菌污染点取样并进行了溯源分析,发现生产环境可能成为阴沟肠杆菌二次污染源,原料品中污染的阴沟肠杆菌经过一系列工序加工后,仍然存在于后续半成品或成品中。

近年来,植物精油作为开发天然食品防腐和抑菌物质的主要来源而受到食品加工工业的关注,百里香酚是牛至和百里香等植物精油的主要成分,大量研究表明,百里香酚对食源性致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌[12]、沙门氏菌[13-14]、紫色色杆菌[15]等有抑菌作用并且对其生物膜的形成有抑制作用。百里香酚目前已被欧盟委员会认定可作为食品中的调味剂(Regulation EU 872/2012),且被美国食品药品管理局认定为公认安全的食品添加剂(21 CFR 182.60)。但百里香酚对食源性致病菌阴沟肠杆菌生物膜的抑制作用国内外未见报道。

本研究以从低温肉制品中分离的优势腐败菌阴沟肠杆菌C4为研究对象,研究百里香酚在亚抑菌浓度下对阴沟肠杆菌生物膜形成的抑制作用。为低温食品的防腐保鲜新技术开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

阴沟肠杆菌C4 为本实验室从低温肉制品中分离并保存;百里香酚(纯度>99%) 由湖北鑫润德化工有限公司提取自植物百里香;胰蛋白胨大豆肉汤(Trypticase Soy Broth TSB)培养基 北京陆桥技术责任有限公司;NuncTMLab-TekTM8孔腔室盖玻片 美国赛默飞;LIVE/DEAD Bac LightTM试剂盒 美国赛默飞;Costar 24孔/96孔细胞培养板 美国Corning公司;RNA prep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司;Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和SYBR® Premix Ex TaqTMII试剂盒 TaKaRa。

Bio Photo meter plus核酸蛋白测定仪 德国 Eppendorf;EVO-LS10扫描电子显微镜 德国蔡司;PE(Ultra View VOX)转盘式激光共聚焦显微镜 铂金埃尔默公司;Gen5 全波长酶标仪 美国博腾。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化和配制百里香酚溶液 将阴沟肠杆菌C4接种于TSB液体培养基中,培养至对数期后在TSB琼脂平板上划线,37 ℃过夜培养后挑选典型单菌落接种到5 mL新鲜TSB培养基中,37 ℃,200 r/min振荡培养过夜,制成含40%甘油的菌悬液,冻存在-40 ℃冰箱中。每次试验前,取冻存的菌液1%接种于5 mL 新鲜TSB培养基中,37 ℃,200 r/min活化12 h备用。百里香酚使用无水乙醇配制浓度为20480 μg/mL的母液置于4 ℃ 冰箱中,后续每次试验前稀释备用并使用0.22 μm 滤膜过滤。

1.2.2 最小抑菌浓度(MIC)及生长曲线的测定 将活化后的菌液按照1%接种到5 mL新鲜TSB培养基中,加入过滤后的百里香酚,菌液和百里香酚按比例混合,二倍稀释法,试管内百里香酚终浓度分别为256、128、64、32 μg/mL,对照组为未加入百里香酚的菌液。37 ℃,200 r/min,每隔2 h取各梯度菌液200 μL加入到96孔板中,Gen5全波长酶标仪测定24 h内孔内吸光度OD600值,绘制阴沟肠杆菌生长曲线,确定百里香酚对阴沟肠杆菌C4的MIC。

1.2.3 对阴沟肠杆菌C4泳动能力的抑制作用 采用软琼脂平板法[16-18]测定泳动能力(swimming和swarming),分别配制swimming培养基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L氯化钠、2.5 g/L葡萄糖和0.3%琼脂)和swarming培养基(25 g/L LB培养基、0.5 g/L葡萄糖和0.5%琼脂),高温灭菌冷却至60 ℃以下后加入百里香酚母液,使其培养基内百里香酚浓度为32、64、128 μg/mL,对照组为不添加百里香酚的培养基。取活化后的菌液1%接种到5 mL新鲜TSB培养基培养至对数期,12000×g离心5 min,移除上清液,无菌PBS缓冲液(pH=7.4)洗涤三次,用无菌生理盐水调节菌悬液的OD600为0.8～1.0之间,每个配制的平板中心表面滴加3 μL菌悬液,分别于37 ℃下静置培养8、20 h。拍照测定细菌扩散菌圈的直径大小。

1.2.4 对阴沟肠杆菌C4生物膜形成的抑制作用

1.2.4.1 对生物膜内活菌总数的测定 按1.2.2的方法配制百里香酚终浓度为32、64、128 μg/mL的菌液,对照组为不添加百里香酚的菌液,24孔板细胞培养板中,每孔添加1 mL不同浓度的菌液,分别培养至12、24、48、72 h,每隔24 h更换一次培养基。培养至待测时间点,将上层培养基缓慢吸出,无菌PBS缓冲液(pH=7.4)轻柔洗涤两次并吸出多余缓冲液,每孔添加1 mL无菌生理盐水,采用无菌棉签仔细擦洗孔壁及孔底边缘处的生物膜,将棉签及孔内液体全部转移到9 mL无菌生理盐水试管中,涡旋震荡5 min,便于使棉签上附着的及生物膜内包裹的细菌充分游离到液体中[19]。10倍梯度稀释至适宜梯度,吸取100 μL液体到琼脂平板上,涂布均匀于恒温培养箱,37 ℃,静置培养24 h,菌落计数。

1.2.4.2 对生物膜胞外多糖的含量测定 按1.2.2的方法配制百里香酚终浓度为32、64、128 μg/mL的菌液,对照组为不添加百里香酚的培养基,24孔板细胞培养板中,每孔添加1 mL不同梯度的菌液,分别培养至12、24、48、72 h,每隔24 h更换一次培养基。培养至待测时间点,将上层培养基缓慢吸出,无菌PBS缓冲液(pH=7.4)轻柔洗涤两次并吸出多余缓冲液,每孔添加1 mL无菌PBS缓冲液(pH=7.4),冲洗培养孔中的生物膜并收集溶液,4 ℃,5000×g离心20 min,收集菌泥,0.85%(v/v)NaCl水溶液(0.22%(v/v)甲醛)重悬菌泥,80 ℃,加热30 min,将加热后的菌悬液4 ℃,15000×g 离心30 min,收集上清液备用[19]。使用苯酚-硫酸法测定生物膜胞外多糖的含量[20]。

1.2.5 对阴沟肠杆菌C4生物膜微观状态的影响

1.2.5.1 扫描电镜(SEM)观察 SEM可以用于观察不同时间点生物膜内菌体聚集后的微观状态。按1.2.2的方法配制百里香酚浓度为1/4 MIC(64 μg/mL)的菌液,对照组为不添加百里香酚的菌液,NuncTMLab-TekTM8孔腔室盖玻片中每孔添加400 μL菌液,分别培养至12、24、48、72 h,每隔24 h更换一次培养基。培养至待测时间点,将上层培养基缓慢吸出,无菌PBS缓冲液(pH=7.4)轻柔洗涤两次并吸出多余缓冲液,室温晾干,去除上层隔板,将载玻片按照样品区间切割后,2.5%(v/v)戊二醛溶液浸泡,4 ℃固定12 h后晾干,使用1%(v/v)的锇酸固定90 min,然后使用含量为30%、50%、80%、90%、100%(v/v)乙醇溶液梯度脱水[21],每次10 min,然后再使用100%(v/v)叔丁醇洗涤。将处理后的玻片喷金用于SEM观察,拍照时选取放大倍数为5000倍[22]。

表1 荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence for real-time PCR

1.2.5.2 激光共聚焦显微镜(CLSM)观察 CLSM可以用来观察不同培养时间下生物膜成膜厚度的变化。按1.2.2的方法配制梯度为1/4 MIC(64 μg/mL)的菌液,对照组为不含百里香酚的菌液,NuncTMLab-TekTM8孔腔室盖玻片中每孔添加400 μL菌液,分别培养至12、24、48、72 h,每隔24 h更换一次培养基。培养至待测时间点,将上层培养基缓慢吸出,无菌PBS缓冲液(pH=7.4)轻柔洗涤两次并吸出多余缓冲液,室温晾干。使用LIVE/DEAD Bac LightTM试剂盒对生物膜进行染色,试剂盒中含有的探针SYTO-9与探针PI能使活、死细胞在激光共聚焦显微镜下呈现绿色、红色荧光,配制染色液,每1 mL无菌 PBS溶液(pH=7.4)中分别加入3 μL试剂盒中的两种染液,染液现配现用并避光保存。在晾干的8孔腔室板中每孔加入染色液400 μL,避光染色30 min,吸除染液后使用无菌PBS溶液(pH=7.4)洗去多余探针,室温晾干,加入2.5%(v/v)戊二醛溶液固定30 min,吸除戊二醛后室温晾干,去除上层腔室隔板,在底板样品表面滴加Bac LightTMMounting Oil,加盖玻片,-20 ℃避光保存用于CLSM观察。观察时SYTO-9激发波长、发射波长分别为485和498 nm,PI的激发波长和发射波长分别为535和637 nm,选取60倍油镜[22-23]。

1.2.6 对阴沟肠杆菌C4生物相关基因表达量的影响 按1.2.2方法制备处理组为百里香酚浓度为1/4 MIC(64 μg/mL)的菌液,对照组为不添加百里香酚的菌液,每孔1 mL菌液滴加到24孔板中,37 ℃静置培养24 h后,移除上层培养基并洗涤后每孔加入1 mL无菌PBS溶液,充分将孔壁及孔底生物膜冲洗溶于液体中,12000×g,4 ℃离心2 min,收集菌泥,使用RNA prep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒提取试剂盒按照说明提取菌体总RNA后,立即反转录为cDNA,反转录反应体系20 μL,其中5×PrimeScript RT Master Mix混合液6 μL、RNA10 μL和RNase Free ddH2O 14 μL。反应条件:37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃ hold。反转录后得到的cDNA存放在-20 ℃冰箱中。实时荧光定量PCR反应体系20 μL,其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 L、引物2 μL、cDNA 2 μL、RNase Free ddH2O 6 μL。反应条件:95 ℃ 30 s预变性;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s 40个循环;95 ℃ 5 s,60 ℃ 60 s 1个循环;50 ℃ 30 s延伸。表1为荧光定量PCR引物序列,目标基因的相对表达采用2-ΔΔCt法评估目标基因的相对表达变化,ΔΔCt=Ct处理组(Ct目标基因-Ct管家基因)-Ct对照组(Ct目标基因-Ct管家基因),以Log2(2-ΔΔCt)>1或Log2(2-ΔΔCt)<-1做为基因高表达的评价标准。

1.3 数据处理

每组试验重复三次,以平均值和标准差表示,试验数据使用Statistix 8.0软件进行显著性分析,(P<0.05为差异显著)。图片处理使用Origin 9.0。

2 结果与分析

2.1 对阴沟肠杆菌C4的最小抑菌浓度(MIC)及生长曲线

图2 百里香酚对阴沟肠杆菌C4泳动能力的影响Fig.2 Effect of thymol on mobile ability of E. cloacae C4注:A:菌体泳动照片;B:Swimming泳动;C:Swarming泳动;大写字母不同代表不同浓度百里香酚处理差异性显著(P<0.05)。

图1表示不同浓度百里香酚处理下阴沟肠杆菌C4的生长曲线,如图所示百里香酚对阴沟肠杆菌C4的最小抑菌浓度为256 μg/mL。当采用质量浓度为256 μg/mL的百里香酚处理时,阴沟肠杆菌C4生长过程被完全抑制;质量浓度为128 μg/mL的百里香酚处理时,抑制部分细菌的生长,细菌的最大生长量低于对照组;64和32 μg/mL百里香酚处理时,生长曲线与对照组无显著差异(P>0.05),不会影响浮游状态下阴沟肠杆菌C4的生长。

图1 阴沟肠杆菌C4生长曲线Fig.1 The growth curve of E. cloacae C4

2.2 百里香酚对阴沟肠杆菌C4泳动能力的抑制

图2表示百里香酚对菌株泳动能力(swarming和swimming)的影响。菌体的泳动能力分为两种,swarming代表群体菌体运动行为,swimming代表单一菌体运动行为。在本实验中百里香酚对菌体swarming能力有剂量反应趋势,百里香酚处理组浓度越高对swarming能力影响越大;如图2B所示,对菌体swimming能力的影响,1/4 MIC和1/8 MIC百里香酚处理组之间没有显著性差异(P>0.05)。使用1/2 MIC处理时,菌体swimming能力被完全抑制。菌体的泳动能力受细菌鞭毛介导,而鞭毛运动在菌体的初始粘附和生物膜形成过程中扮演重要角色[24-26],实验结果表明百里香酚显著降低菌体的泳动能力,可能会影响细菌生物膜的形成。

2.3 对阴沟肠杆菌C4生物膜形成的影响

2.3.1 生物膜内菌数的变化 图3反映百里香酚在72 h内对阴沟肠杆菌C4生物膜内活菌总数的影响。32和64 μg/mL百里香酚处理组和对照组之间活菌总数没有显著性差异(P>0.05),128 μg/mL百里香酚在12、24 h取样点生物膜内活菌总数显著(P<0.05)低于其他浓度处理组和对照组。培养至48 h之后与对照组无显著性差异(P>0.05),结合图1百里香酚对细菌生长曲线的影响分析,可能128 μg/mL百里香酚在生物膜形成初期影响细菌的增殖,而随着细菌生物膜的成熟,生物膜结构对膜内细菌有保护作用,百里香酚在此浓度下失去了对生物膜内细菌增长的抑制作用。

图3 百里香酚对阴沟肠杆菌C4生物膜内菌数的影响Fig.3 Effect of thymol on the bacterial countsin E. cloacae C4 biofilm注:大写字母不同代表相同处理浓度在不同时间点差异显著;小写字母不同代表在相同时间点不同处理浓度显著差异(P<0.05);图4同。

2.3.2 生物膜内胞外多糖含量的变化 胞外多糖是细菌生物膜维持其三维结构的主要成分,既是生物膜结构的基础,又是功能的主要承担者[27-28]。因此,抑制或减少细菌胞外多糖的合成和分泌,是抑制生物膜形成的重要手段。通过苯酚-硫酸法测定葡萄糖糖浓度-吸光度标准曲线作为后期胞外多糖定量标准。线性关系y=0.0086x+0.0753(R2=0.99),如图4所示,对照组胞外多糖含量随着培养时间的延长而增加,说明在生物膜的形成过程中,不断分泌胞外多糖增加生物膜的稳定性,提高对外界环境的适应力。64和128 μg/mL香芹酚处理组胞外多糖含量在不同的培养时间内均显著低于对照组(P<0.05)。在相同培养时间内,百里香酚处理组浓度越高,抑制生物膜胞外多糖分泌效果越好。

图4 百里香酚对阴沟肠杆菌C4生物膜胞外多糖合成的影响Fig.4 Effect of thymol on exopolysaccharide ofE. cloacae C4 biofilm

2.4 对阴沟肠杆菌C4生物膜微观状态的影响

图6 百里香酚对阴沟肠杆菌C4生物膜的抑制作用Fig.6 Effect of thymol on biofilm of E. cloacae C4 注:A:对照组 B:64 μg/mL百里香酚处理组。

2.4.1 SEM观察生物膜内菌体聚集后的微观状态 图5表示SEM观察阴沟肠杆菌C4生物菌膜内菌体的聚集状态,培养至12 h时,处理组和对照组均呈单层粘附,处理组菌体之间无连接,处理组单层排列,观察到视野内单个菌体杆状变长;培养至24 h时,处理组菌体之间互相黏连,依然呈单层排列,对照组菌体之间出现聚集体,形成多层结构;培养至48 h之后,对照组和处理组生物膜成熟,菌体多层包裹在一起,观察到胞外基质的形成,随着培养时间的延长,生物膜结构越复杂。

图5 百里香酚对阴沟肠杆菌C4生物膜菌体聚集状态的影响(5000×)Fig.5 Effect of thymol on cell aggregationin E. cloacae C4 biofilm(5000×)注:A:对照组 B:64 μg/mL百里香酚处理组。

2.4.2 CLSM观察生物膜成膜厚度的变化 如图6所示,使用CLSM观察百里香酚对不同培养时间阴沟肠杆菌C4生物膜成膜厚度的影响,发现对照组和处理组生物膜随着培养时间的增加,生物膜厚度不断加厚,膜结构越来越紧密平整,64 μg/mL百里香酚处理的生物膜与同时间段的对照组相比,成膜厚度降低,生物膜有不平整、膜结构松散。

2.5 对阴沟肠杆菌C4生物膜相关基因表达量的影响

图7表示64 μg/mL百里香酚处理后阴沟肠杆菌C4与生物膜相关基因的表达量变化,培养24 h之后,与生物膜形成相关的6个目的基因的相对表达量高表达下调((Log22-ΔΔCt)<-1);csgB、csgE、csgF是生物膜粘附相关基因,wcaA、wcaM、wza是与胞外多糖合成相关基因,这些目的基因均下调与前边的生物膜表征变化相一致,进一步说明百里香酚抑制生物膜形成主要通过影响生物膜的初始粘附过程和减少胞外多糖的合成。

图7 阴沟肠杆菌C4生物膜内菌体细胞内相关基因表达量变化Fig.7 Changes of relative expression levels ofbiofilm-related genes in E.cloacae C4

3 结论

本实验选取的百里香酚(64 μg/mL)在不影响浮游细菌生长的情况下有效抑制阴沟肠杆菌C4生物膜的形成,避免增加细菌的耐药性;对照组和64 μg/mL处理组的生物膜内活菌总数无显著差异(P>0.05),说明百里香酚的抑制作用跟生物膜内粘附菌数没有关系;SEM和CLSM观察发现经百里香酚处理后,与对照组相比,细菌菌体形状变长,生物膜聚集体形成缓慢,菌体之间连接不紧密,生物膜厚度降低。百里香酚可以显著(P<0.05)抑制菌体泳动能力和胞外多糖的合成,并且与此相关功能基因的相对表达量下调表明,百里香酚通过调控生物膜相关功能基因的表达来抑制阴沟肠杆菌生物膜的形成,而关于百里香酚如何具体影响鞭毛介导运动的调控通路和胞外多糖合成的调控机制仍需进一步的研究。