(天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457)

生物活性肽作为一种功能性食品,不仅具有丰富的营养价值,而且具有抗氧化、抗癌、抑菌、降血压、免疫调节等多种生物活性,在人们的日常生活中发挥着不可或缺的作用[1]。据研究表明,水解得到的不同种生物活性肽在神经系统、心血管系统、消化系统和免疫系统中均发挥着重要生理作用[2]。

为了避免或延缓食品变质和营养价值的流失,丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ)、没食子酸丙酯等合成抗氧化剂由于具有较强的抗氧化能力,被广泛应用于食品工业中[3]。然而,由于合成抗氧化剂的毒性,其使用量是受限制的[4]。近年来膳食来源的天然抗氧化剂由于容易吸收和低毒性引起了人们的广泛关注,如大豆[5]、羊奶蛋白质[6]、鹰嘴豆蛋白水解物[7]、油菜籽[8]等。

蛋清蛋白中生物活性肽含量丰富,可作为一种优质的食物蛋白质来源。蛋清水解物和多肽不仅可以为人类提供基本的营养需求,而且具有多种生物活性,如抗菌[9-10]、抗癌降压[11-12]以及抗氧化活性[13-15]。除此之外,蛋清蛋白中所含氨基酸的种类和比重更有利于人体生长发育的需要,是一种理想的食用蛋白,且易于人体肠道消化吸收[16]。采用酶水解蛋清蛋白质制备生物活性肽能有效地利用我国丰富的禽蛋资源,提高禽蛋的附加值,产生巨大的经济和社会效益。我国对鸡蛋蛋白的精细加工研究正逐步深入,但有关蛋清肽类物质发挥特定功能机理的研究仍处于初步探索阶段,因此本试验以鸡蛋清为原料,通过酶解法制备抗氧化肽,对蛋清多肽进行体外和体内抗氧化活性研究,为蛋清多肽的深度开发利用提供一定的理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋 市售;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma公司;碱性蛋白酶(酶活力160000 U/g)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;SPF昆明雌性小鼠(60只,每只20 g左右,常规饲养1周后使用) 北京斯贝福实验动物有限公司,实验动物质量合格证编号:SCXK(京)2016-0002;其他试剂分析纯。

UV-2550PC紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器公司;MK3酶标仪 美国BIO-TEK公司;RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;LM-125中空纤维超滤装置 北京旭邦膜设备有限责任公司;ST16R冷冻离心机 美国Thermo公司;BK-FD12S冷冻干燥机 山东博科生物产业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋清多肽(EWP)的制备配制 底物浓度10%的蛋清溶液,用碱性蛋白酶在pH10.0,50 ℃,加酶量1.5%(w/w)的条件下水解3 h,沸水中加热10 min以终止反应,8000 r/min离心20 min,上清液经过截留分子质量为10 kDa的平板膜进行超滤分离,收集分子量小于10 kDa的多肽酶解液,冷冻干燥以备后续使用。

1.3 蛋清多肽体外抗氧化活性的测定

1.3.1 DPPH自由基清除能力的测定 参照文献的方法,并进行适当的修改[17]。将DPPH溶解在95%乙醇中,制备成0.2 mmol/L的DPPH溶液。将2 mL EWP溶液(溶于去离子水中,浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL)和2 mL DPPH溶液混合,在暗处室温孵育30 min,在517 nm处测定样品组吸光度。将2 mL乙醇代替样品与2 mL DPPH溶液混合作为对照组。将2 mL样品与2 mL乙醇混合作为空白组。使用相同浓度的VC作为阳性对照。

其中:A1为样品组吸光度,A2为空白组吸光度,A3为对照组吸光度。

1.3.2 羟自由基清除能力的测定 参照文献的方法,并进行适当的修改[18]。反应体系(4 mL)由1 mL H2O2(8.8 mmol/L)、1 mL FeSO4(9 mmol/L)、1 mL水杨酸(9 mmol/L)和1 mL样品溶液(浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL)组成,H2O2最后加入以启动反应。然后37 ℃孵育30 min,在510 nm测定吸光度Am。用蒸馏水代替水杨酸,测定吸光度An。用蒸馏水代替样品作为空白对照组,测定吸光度Ap。使用相同浓度的VC作为阳性对照。

其中:Am为样品组吸光度,An为不含水杨酸的吸光度,Ap为空白组的吸光度。

1.3.3 总还原能力的测定 将2.5 mL样品(浓度分别为2、4、6、8、10、12 mg/mL)加入到2.5 mL 1% K3Fe(CN)6溶液里,再加入2.5 mL pH6.6磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L),在50 ℃下保温20 min,再加入2.5 mL 10% TCA,混匀后在4000 r/min条件下离心10 min,取上清液5 mL,依次加入5 mL H2O和1 mL 0.1% FeCl3,在700 nm处测定吸光度值A700。使用相同浓度的VC作为对照组。

1.4 蛋清多肽抗氧化动物试验

1.4.1 动物试验设计 60只健康小鼠,饲养条件分别为温度20～22 ℃,湿度保持在40%～60%,明暗交替喂养12 h,自由进食进水一周。将60只小鼠随机分为6组,分别为正常组、模型组、低、中、高剂量组和阳性对照组(VC组)。除正常组每天皮下注射生理盐水之外,其余各组小鼠每天颈部皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg),正常组和模型组每天灌胃0.2 mL 0.9%生理盐水,低、中、高剂量组分别按照150、300、900 mg/kg的蛋清多肽进行给药,阳性对照组每天灌胃300 mg/kg的VC。连续注射、灌胃6周,每周称量一次体重以调整注射量和灌胃量。

1.4.2 样品采集 试验期结束后,禁食不禁水12 h后眼球取血,肝素抗凝,4 ℃ 3500 r/min离心10 min以制备血清。断颈处死后解剖小鼠,摘取肝脏、心脏,用生理盐水清洗干净后,用滤纸吸干多余水分,称取适量肝脏组织及心脏组织于研磨器中,加入生理盐水或提取液,迅速研磨以制备10%的组织匀浆,在4 ℃ 3000 r/min离心10 min以获取上清液。

1.4.3 生化指标的测定 小鼠的血清、肝脏及心脏中的超氧化物歧化酶(SOD)的活力、丙二醛(MDA)的含量和还原型谷胱甘肽(GSH)的含量,参考试剂盒说明书。

1.5 数据处理

所有试验结果均用“平均数±标准差”表示,采用SPSS 19.0软件进行数据分析整理。

2 结果与分析

2.1 蛋清多肽对DPPH自由基的清除能力

DPPH法用于评价天然抗氧化剂的自由基清除具有方便快捷等优点[19]。从图1可以看出,蛋清多肽对DPPH自由基的清除能力随着浓度的增加而增加,具有良好的量效关系,当浓度为4 mg/mL时DPPH自由基的清除率与VC差距进一步缩小,可达到65.7%。说明蛋清多肽具有良好的DPPH自由基的清除能力。

图1 蛋清多肽对DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging activity of EWP on DPPH radical

2.2 蛋清多肽对羟自由基清除能力

羟自由基作为活性最强的氧自由基能引起相邻的生物分子间的严重损伤,从而引起衰老、癌症和多种疾病[20]。从这个角度来看,清除羟自由基是最有效的预防各种疾病的手段之一。从图2可以看出,蛋清多肽对羟自由基清除能力与浓度呈正相关,当浓度为5 mg/mL时清除效果最显著,达到68.5%的清除率。说明蛋清多肽对羟自由基清除能力较好。

图2 蛋清多肽对羟自由基的清除能力Fig.2 Scavenging activity of EWP on hydroxyl radical

2.3 蛋清多肽的总还原能力

从图3可以看出,蛋清多肽的总还原能力随着浓度的增加而提高,且具有明显的量效关系,在浓度为12 mg/mL的时候总还原能力OD值为2.032,低于VC(OD值2.88)。说明蛋清多肽具有一定的总还原能力。

图3 蛋清多肽的总还原能力Fig.3 Deoxidization capacity of EWP

2.4 蛋清多肽对小鼠血清中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影响

SOD作为机体天然存在的自由基清除因子,可阻止因氧自由基产生的细胞损伤,并及时修复受损细胞,它的水平高低与各种疾病发生有着紧要联系[21]。MDA是脂质过氧化重要产物之一,其产生会加剧膜损伤,它的含量可以用于评价脂质过氧化程度[22]。GSH可清除掉人体内的自由基,保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基[23]。

由表1可知,模型组SOD活力、GSH含量相比正常组极显著下降(P<0.01),MDA含量极显著上升(P<0.01),说明建模成功。与模型组相比,SOD活力低、中剂量组显著上升(P<0.05),GSH 含量低剂量组显著上升(P<0.05),中剂量组极显著(P<0.01),MDA含量中剂量组显著降低(P<0.05),高剂量组达到极显著差异水平(P<0.01)。综上,蛋清多肽能提高衰老小鼠血清中SOD活力、GSH含量,降低MDA含量,且随着浓度的增大,活性也增大,其中高剂量组效果最好,GSH含量优于VC对照组,SOD活力、MDA含量接近VC对照组。说明蛋清多肽在血清中抗氧化效果较好。

表1 蛋清多肽对小鼠血清中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影响Table 1 Effect of EWP on SOD activity,MDA and GSH content in serum of mice

注:*与正常组相比,有显著性差异(P<0.05);**与正常组相比,有极显著性差异(P<0.01);#与模型组相比,有显著性差异(P<0.05);##与模型组相比,有极显著性差异(P<0.01);表2、表3同。

2.5 蛋清多肽对小鼠肝脏中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影响

由表2可知,模型组SOD活力、GSH含量相比正常组极显著下降(P<0.01),MDA含量极显著上升(P<0.01),即建模成功。低剂量组与模型组相比差异不显著(P>0.05),中剂量组MDA含量及GSH含量达到显著差异水平(P<0.05)、SOD活力达到极显著差异水平(P<0.01),高剂量组极显著(P<0.01)。这说明蛋清多肽能提高衰老小鼠肝脏组织中SOD活力、GSH含量,降低MDA含量,且随着浓度的增大,活性也增大,其中高剂量组效果最好,肝脏中SOD活力与GSH含量接近VC对照组。说明蛋清多肽在肝脏中抗氧化效果较好。

表2 蛋清多肽对小鼠肝脏中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影响Table 2 Effect of EWP on SOD activity,MDA and GSH content in liver of mice

2.6 蛋清多肽对小鼠心脏中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影响

由表3可知,模型组SOD活力、GSH含量相比正常组极显著下降(P<0.01),MDA含量极显著上升(P<0.01),说明建模成功。与模型组相比,GSH含量低、中剂量组显著上升(P<0.05),SOD活力中剂量组显著上升(P<0.05),MDA含量中剂量组显著下降(P<0.05),高剂量组与VC对照组各指标达到极显著差异水平(P<0.01)。综上,蛋清多肽能提高衰老小鼠心脏组织中SOD活力、GSH含量,降低MDA含量,且且随着浓度的增大,活性也增大,其中高剂量组效果最好,各指标水平接近VC对照组。说明蛋清多肽在心脏中抗氧化效果较好。

表3 蛋清多肽对小鼠心脏中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影响Table 3 Effect of EWP on SOD activity,MDA and GSH content in heart of mice

张玲等用欧李仁多肽灌胃小鼠,发现不同剂量组可显著提高小鼠血清和肝脏中SOD、GSH-Px活性(P<0.05),显著降低血清和肝脏中MDA的含量(P<0.05)[24]。万全等用黄缘盒龟多肽灌胃小鼠,发现其可提高小鼠血清、肝和脑组织中的SOD活力和 GSH含量,抑制MDA含量的增加,且抗氧化效果与浓度有良好的量效关系[25]。与本试验结果统一。

3 结论

蛋清多肽对DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和总还原能力效果都较好,其中浓度为5 mg/mL时,DPPH自由基清除率和羟自由基清除率分别达到69.2%和68.5%,且清除率都随着浓度的增大而增加,量效关系较为明显。动物试验表明,与模型组相比,蛋清多肽可显著提高衰老小鼠血清、肝脏和心脏组织中SOD活力、GSH含量(P<0.05),显著降低血清、肝脏和心脏组织中MDA含量(P<0.05),且且随着浓度的增大,活性也增大,其中高剂量组效果最好。这说明蛋清多肽可以在一定程度上抑制机体损害,提高衰老小鼠的抗氧化能力。本研究为蛋清多肽的精深研究与加工提供了理论支持,蛋清多肽作为一种天然的抗氧化剂,开发利用价值较高。