,2,*,2,2

(1.晨光生物科技集团股份有限公司,河北邯郸 057250;2.河北省植物天然色素技术研究院,河北邯郸 057250)

银杏叶又称白果叶,具有很高的药用价值[1-3]。银杏叶的主要成分是黄酮和银杏内酯成分,这两种物质可以有效地降低胆固醇,具有舒张血管、活血化瘀等功效,可用于高血脂、心脑血管、中风偏瘫等疾病的治疗[4-5]。因此,银杏叶提取物也成为保健品的重要原料之一。

咖啡因是一种三黄基生物嘌呤碱[6],普遍存在于咖啡豆、茶叶、巧克力、软饮料等食品中。其主要作用是刺激大脑中枢神经兴奋,适度摄入咖啡因可以有效提神醒脑[7-8],用于治疗抑郁症、神经衰弱和昏迷复苏等,但过度摄入咖啡因容易让人产生依赖感,引起烦躁、焦虑症状,甚至致命[9-11]。咖啡因属于保健食品中减肥类保健食品中违法添加药物,因此有效检测咖啡因含量是对广大消费者的保障。

目前对于银杏叶提取物的检测,主要是针对黄酮和银杏内酯成分,对其含有的咖啡因检测极少。检测咖啡因的常见方法包括高效液相色谱法[12-15]、紫外分光光度计法[16-17]、气相色谱法[18-19]和气质联用法[20-21]。跟上述方法相比,超高效液相色谱-串联质谱法[22-24]具有灵敏、快捷的优势。

本文主要采用超高效液相色谱-串联质谱法检测银杏叶、银杏提取物及其提取过程中间产物中咖啡因含量,研究咖啡因转移规律,为行业的规范生产提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈 色谱纯,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;甲酸 分析纯,天津市永达化学试剂有限公司;超纯水 实验室纯水机制备;0.2%甲酸溶液、含0.2%甲酸的乙腈、咖啡因(C8H10N4O2,CAS:202282-98-2) 纯度≥98%,北京世纪奥科生物技术有限公司;银杏叶 云南、江苏邳州、陕西、浙江产地;银杏叶提取物 市售和自制(工艺路线参照文献[25]);银杏叶提取液和银杏叶渣 自制(工艺路线参照文献[25])。

Acquity UPLC-TQD超高效液相色谱-串联质谱仪 沃特世科技(上海)有限公司;KQ-400DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;AUW220电子天平 苏州华宏仪表有限公司;H-2O50R高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 银杏叶提取物的前处理 准确称取0.1 g(精确到0.0001)银杏叶提取物,置于100 mL容量瓶中,加入少量30%甲醇溶液,在温度为30±0.5 ℃,超声处理5 min,再用30%甲醇溶液定容至刻度线。根据实际浓度适当稀释至线性范围内,过滤膜(0.22 μm),装小瓶,供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.2 银杏叶和银杏叶渣的前处理 准确称取1.0 g(精确到0.0001)银杏叶和银杏叶渣,置于250 mL锥形瓶中,加入100 mL 30%甲醇溶液超声1 h,超声温度为30±0.5 ℃,根据实际浓度适当稀释至线性范围内,用0.22 μm滤膜过滤,装小瓶,供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.3 银杏叶提取液的前处理 准确称取1.0 g(精确到0.0001)银杏叶提取液置于50 mL塑料管中,加入10 mL 30%甲醇溶液,在温度为30±0.5 ℃,超声处理10 min。根据实际浓度适当稀释至线性范围内,用0.22 μm滤膜过滤,装小瓶,供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.4 液相色谱条件的优化 流动相采用0.2%甲酸溶液和含0.2%甲酸的乙腈;色谱柱采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,2.7 μm);进样量为5 μL;柱温为30 ℃;流速为0.3 mL/min。通过改变流动相梯度条件,达到最快最优的分离结果。比较了3组流动相梯度洗脱方式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,梯度洗脱方式Ⅰ为0～2 min:A=90%,B=10%;2～2.1 min:A由90%变为10%;2.1～4 min:A=10%;4～4.1 min:A由10%变为90%;4.1～5 min:A=90%。梯度洗脱方式Ⅱ为0～5 min:A=95%,B=5%;5～6 min:A由95%变为2%;6～7 min:A=2%;7～7.5 min:A由2%变为95%;7.5～9 min:A=95%。梯度洗脱方式Ⅲ为0～5 min:A=95%,B=5%;5～22 min:A由95%变为2%;22～27 min:A=2%;27～27.5 min:A由2%变为95%;27.5～32 min:A=95%;最终确定对目标物分离效果和灵敏度最优的一组流动相梯度洗脱方式。

1.2.5 质谱条件的确定 将63.84 μg/L的目标物标准溶液用注射器10 μL/min的流速连续注射进入 ESI 离子源,在正离子模式下进行一级质谱分析(Q1 扫描),得到准分子离子峰[M-H-峰],确定母离子后,对离子源温度、毛细管电压、脱溶剂气等参数进行优化,使母离子扫描响应达到最高。再对准分子离子峰进行二级质谱分析,得到响应较高的2个碎片离子分别作为定量离子和定性离子和各自对应的碰撞能量。

1.3 咖啡因的测定

1.3.1 标准储备溶液的配制 称量纯度为98%的咖啡因标准品407.1 mg,用色谱级甲醇定容至50 mL容量瓶,配制成7.98 mg/mL标准储备液,溶液转移至棕色标样试剂瓶中后在-20 ℃下避光保存。

1.3.2 标准系列工作溶液的配制 精密准确移取标准储备液,配制浓度为31.92、15.96、7.98、3.99、1.995、0.9975、0.499、0.249 μg/L的系列标准溶液,现用现配。

1.3.3 仪器方法学实验 将标准品溶液分别日内和日间连续进样检测5次,分析咖啡因目标峰面积的日内精密度和线性方程斜率的日间精密度情况。

1.3.4 加标回收率实验 选择银杏叶和银杏叶提取物进行加标回收率实验,加标水平是含量的50%和100%,验证检测方法的准确性。

1.3.5 精密度和重现性考察实验 选择银杏叶和银杏叶提取物样品分别做日内和日间检测,各检测5次,分析日内精密度和重现性情况。

1.3.6 线性范围和检出限 本研究采用标准曲线进行校准定量,配成一系列标准溶液,浓度为31.92、15.96、7.98、3.99、1.995、0.9975、0.499、0.249 μg/L,以仪器响应峰面积对咖啡因的质量浓度绘制标准曲线。

1.3.7 不同地区银杏叶和不同批次的银杏叶提取物中咖啡因含量的评价 选取云南、江苏邳州、陕西、浙江的银杏叶和不同批次的银杏叶提取物样品进行检测,按照优化好的超高效液相色谱-串联质谱仪进行测定,评价其中咖啡因的含量。

1.3.8 银杏叶提取过程中咖啡因转移分析 用实验制备的产品进行咖啡因迁移规律实验,银杏叶经溶剂提取、浓缩、萃取、离心、吸附解析后所得银杏叶提取物[25]。分别测定各个环节的产品中咖啡因含量,根据重量得率计算总体咖啡因含量,以此得出咖啡因转移规律。

1.3.9 咖啡因残留量计算方法

式中：Ca指的是银杏叶提取过程所得到产品的咖啡因质量浓度,单位是mg/kg;Ct指的是银杏叶中咖啡因的质量浓度,单位是mg/kg;ma指的是银杏叶提取过程所得到产品的总质量,单位是mg;mt指的是银杏叶的总质量,单位是mg;A%指的是过程品产中咖啡因含量占银杏叶中咖啡因的百分比,单位是%。

表2 目标化合物咖啡因的质谱参数Table 2 UPLC-MS/MS parameters for quantitation and confirmation

注:* 定量离子。2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

根据咖啡因的化学结构,本文采用了三种流动相梯度洗脱方式,实验结果图1～图3所示,其中,梯度洗脱方式Ⅰ需要5 min,梯度洗脱方式Ⅱ需要9 min,梯度洗脱方式Ⅲ需要32 min。且采用梯度洗脱方式Ⅰ的样品中咖啡因质谱图的目标峰形明显优于Ⅱ和Ⅲ,咖啡因在约1.4 min处就可以实现检测,且杂质不影响咖啡因的出峰。因此选择流动相梯度洗脱方式Ⅰ是对目标物分离效果和灵敏度最优的一组流动相梯度洗脱方式。

图1 采用流动相洗脱方式Ⅰ的咖啡因色谱图Fig.1 Chromatogram of caffeine adoptedmobile phase elution mode of Ⅰ

图2 采用流动相洗脱方式Ⅱ的咖啡因色谱图Fig.2 Chromatogram of caffeine adoptedmobile phase elution mode of Ⅱ

图3 采用流动相洗脱方式Ⅲ的咖啡因色谱图Fig.3 Chromatogram of caffeine adoptedmobile phase elution mode of Ⅲ

最终确定的液相色谱条件为:流动相A:0.2%甲酸溶液;流动相B:含0.2%甲酸的乙腈;色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,2.7 μm);进样量:5 μL;柱温:30 ℃;流速:0.3 mL/min;运行时间:5 min;梯度洗脱如表1所示。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase composition for linear gradient elution

2.2 质谱条件的选择

最终优化的质谱条件:离子源:电喷雾离子源(ESI);检测方式:多反应监测(MRM);扫描方式:正离子模式;毛细管电压:正离子模式,4000 V;离子源温度:120 ℃;脱溶剂气流量:700 L/h。目标化合物咖啡因的保留时间、母离子和子离子、碰撞能量见表2。

2.3 标准曲线绘制

表3 仪器检测精密度Table 3 Intra-precision of instrument

表4 仪器的重现性测试Table 4 Reproducibility test of instrument

表5 银杏叶及银杏叶提取物中咖啡因检测加标回收率Table 5 Recoveries of coffeine in ginkgo and ginkgo extracts

本研究采用标准曲线进行校准定量,配成一系列标准曲线(31.92、15.96、7.98、3.99、1.995、0.9975、0.499、0.249 μg/L),以仪器响应峰面积对咖啡因的质量浓度绘制标准曲线,标准曲线是y=2157.58x+45.0077,相关系数是0.9970。

图4 咖啡因的标准曲线Fig.4 Standard curve of caffeine

2.4 仪器的方法学考察

2.4.1 日内精密度 将标准品溶液分别日内连续进样检测5次,分析咖啡因浓度的日内精密度情况,分析两天的数据,结果表明:仪器检测咖啡因峰面积的日内精密度均在3%以内,说明标准品溶液的日内稳定性较好,仪器检测的日内精密度较高,满足测试需求。具体见表3。

表6 银杏叶和银杏叶提取物中咖啡因检测日内精密度数据Table 6 The intra-precision data of caffeine in ginkgo and ginkgo extracts

2.4.2 日内精密度 将同一份标准品溶液不同天的检测咖啡因浓度数据进行汇总,分析标准品溶液的峰面积日间精密度情况,结果表明:仪器检测标准品溶液的峰面积日间精密度小于5%,说明方法日间精密度较好,仪器检测的日内精密度较高,满足测试需求。具体见表4。

2.5 检测方法准确性验证

加标回收率考察:选择云南的银杏叶及购买不同厂家的银杏叶提取物分别做加标回收率实验,验证检测方法的准确性。结果表明:使用标准曲线外标法计算的各类样品的加标回收率基本在90%～110%左右,检测准确性较高。结果如表5所示。

2.6 检测方法的方法学验证

2.6.1 日内精密度验证 选择陕西银杏叶和购买不同厂家的银杏叶提取物分别做日内检测,检测5次,分析精密度情况,结果表明,样品的日内和日间RSD<10%,满足检测需求。

2.6.2 日间精密度验证 选择陕西银杏叶和购买不同厂家的银杏叶提取物样品分别做日间检测,检测5次,分析精密度情况,结果表明,样品的日内和日间RSD<10%,满足检测需求。

2.6.3 检测灵敏度 当取样量为1 g,定容体积为10 mL时,本方法中咖啡因的测定检出限5 μg/kg;定量限为15 μg/kg。

2.7 银杏叶及银杏叶提取物中咖啡因含量评价

2.7.1 不同地区银杏叶中咖啡因含量评价 采集四个产地的银杏叶,烘箱烘干后对其进行粉碎,测定其咖啡因含量。结果如表8所示,根据检测结果可知,不同产地的银杏叶测定的咖啡因含量不一,可能与生长的气候、产地有关系。

表7 银杏叶和银杏叶提取物中咖啡因检测日间精密度数据Table 7 The inter-precision data of caffeine in ginkgo and ginkgo extracts

表8 不同产地的银杏叶中咖啡因检测数据Table 8 The data of caffeine in ginkgo from different origins

2.7.2 银杏叶提取物中咖啡因含量评价 如下表9所示,选取市场上不同批次的银杏叶提取物,检测其中咖啡因含量,发现银杏叶提取物中咖啡因含量差别较大,推断其咖啡因含量高低与银杏叶中咖啡因含量高低有直接关系,原因可能是由于银杏叶产地来源不同及提取工艺不同所导致[26]。

表9 银杏叶提取物中咖啡因检测数据Table 9 The data of caffeine in different ginkgo extracts

2.7.3 银杏叶及银杏叶提取物中的咖啡因转移规律 通过上述银杏叶及银杏叶提取物中咖啡因含量的检测,发现都存在咖啡因,表明银杏叶提取物中的咖啡因来源是银杏叶。为得到合格的产品,实验室对银杏叶提取的整个过程进行重现和各个工艺点进行检测,以期获得咖啡因的转移规律。工艺流程如下图5所示。

图5 银杏叶提取物的提取工艺流程Fig.5 Extraction technology process ofginkgo biloba leaf extract

用实验制备的产品进行咖啡因转移规律实验,将100 g银杏叶经溶剂提取、浓缩、萃取、离心、解析所得银杏叶提取物进行测定[25]。根据测得各步产品质量和咖啡因质量浓度数据计算各步产品中咖啡因的总质量,求得咖啡因百分比,计算方法参考1.3.9。

实验结果如表10所示,银杏叶提取后所得银杏叶料渣中咖啡因残留量约为34%,提取液1中咖啡因占比约为66%。将提取液1浓缩后发现浓缩液中咖啡因含量变为约43%,含量降低了约23%,可能是旋蒸时醇溶剂中溶解了一部分咖啡因。浓缩液再经萃取得到的提取液2中咖啡因含量几乎没变化,然后提取液2离心后得到的提取液3中咖啡因占比约39%,可能是离心过程中离心渣子中残留一部分咖啡因,离心液经树脂吸附解析后,最终得到的银杏叶提取物中咖啡因占比约为35%。因此,从整个工艺流程看来,银杏叶中的咖啡因主要是转移到了料渣和离心渣中,其次是浓缩时转移到了溶剂中,原料中约35%的咖啡因转移到了产品中。通过测定两批咖啡因含量不同的银杏叶,其银杏叶提取物中咖啡因含量高低直接和银杏叶中咖啡因含量高低有关系。

表10 银杏叶提取过程中咖啡因含量Table 10 The content of caffeine in theprocess of ginkgo biloba extraction

3 结论与讨论

采用超高效液相色谱串联质谱法检测银杏叶及银杏叶提取物中咖啡因含量,该方法简便快速,5 min内可实现目标物检测。通过测定各地银杏叶,发现不同产地的银杏叶中咖啡因含量是不同的。以此推断银杏叶中含有咖啡因,且咖啡因含量高低可能与生长的气候、产地有关系。

通过对银杏叶提取过程中半成品进行检测显示,银杏叶提取后所得的银杏叶渣中咖啡因残留约占34%,其提取液1中咖啡因约占66%,提取液1浓缩后浓缩液中咖啡因含量约为43%,由于咖啡因易溶于醇[27],可能是旋蒸过程咖啡因溶于溶剂被带走,浓缩后再经萃取咖啡因含量几乎没变化,然后提取液2离心后得到提取液3中咖啡因占比约为39%,可能是离心过程中离心渣中残留一部分咖啡因,离心液经树脂吸附解析后,最终得到的产品中咖啡因占比约为35%。因此,银杏叶中咖啡因主要是转移到料渣和离心渣中,其次在浓缩时转移到了溶剂中,原料中约35%的咖啡因转移到了产品中。实验证明,银杏叶中咖啡因是天然存在的,银杏叶提取物中的咖啡因是银杏叶中咖啡因部分转移的结果。因此对银杏叶提取加工提出以下建议,一是规范原料标准,二是优化生产工艺。