孔垂民,张 灿,李军伟,刘文华

(青岛农业大学动物医学院,山东 青岛 266109)

实验动物对于生命科学研究和生物技术的发展发挥着不可替代的作用,其健康程度关系到试验成果的科学性。实验小鼠作为实验动物的重要组成部分,寄生虫感染一直是影响实验小鼠健康及实验效果的主要病原体之一。并且某些寄生虫疾病属于人兽共患病,严重威胁研究人员及养殖人员的身体健康,所以对小鼠肠道寄生虫病进行及时诊断意义重大。

四翼无刺线虫(Aspiculuris tetraptera)和隐匿管状线虫(Syphacia obvelata)同属尖尾目、尖尾科、土源性寄生虫,是小鼠常见的肠道寄生虫,同为人兽共患寄生虫[1]。两种线虫生活史均为直接发育型,多宿主寄生虫,在实验小鼠的肠道中常见,多混合感染。也有关于人感染此两种线虫的报道[2]。小鼠严重感染两种线虫时,会导致肠道功能紊乱,影响增重,生理生化指标发生改变,影响动物试验结果。

2017 年10 月,某实验动物养殖场送检20 只C57BL/6 小鼠,小鼠被毛粗乱无光泽、消瘦、食欲减退、聚堆,反应迟钝。经询问养殖人员了解到,发病场房养殖密度100 只/m2,小鼠大范围出现上述临床症状,严重生长发育不良,体重不达标,但小鼠无大范围死亡现象。经抗生素治疗,无明显效果。送实验室检测,怀疑寄生虫感染,对粪便进行检查,剖检小鼠,通过显微镜对发现的虫卵及虫体进行了初步的形态学鉴定,然后提取DNA,进行18S rDNA 基因片段的扩增和序列分析,诊断结果表明,送检的小鼠均感染S.obvelata和A.tetraptera,具体过程报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物来源及主要试剂 某实验动物养殖场送检的C57BL/6 小鼠20 只。DNA 裂解液及PCR 试剂购自TaKaRa 公司。

1.2 虫卵观察 收集C57BL/6 小鼠的新鲜粪便,饱和盐水漂浮法分离粪便中的虫卵,显微镜下观察虫卵形态。

1.3 小鼠肠道病变观察及虫体镜检 对小鼠禁食24 h 后,脱颈处死,消毒后剖检,观察各脏器病变,分别对小鼠的十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠进行分段剖检,将剖检后的肠道及其内容物一同放入盛有生理盐水的玻璃平皿中,用异物针挑取虫体,显微镜下观察虫体形态。

1.4 18S rDNA 基因的扩增及序列分析

1.4.1 虫体基因组DNA 的提取 根据寄生虫镜检情况,挑取外部形态相同的10～15 条虫体到PBS中,吹打洗涤3 次后,置于1.5 mL 离心管中,加入100 μL DNA 裂解液,按照DNAiso Reagent 说明书分别提取2 种线虫的基因组DNA,于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 18S rDNA 基因的PCR 扩增及序列分析以提取的2 种线虫的DNA 为模板,Vandergast 等[3]使用的18S-5F/18S-9R 为引物,分别对两种线虫的18S rDNA 基因进行PCR 扩增。将PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,与预期片段大小一致的PCR产物送往上海派森诺生物股份有限公司进行测序。测序结果与NCBI 网站核酸数据库进行Blast 比对,比对结果用MEGA7 进行遗传进化关系分析。

2 结果

2.1 粪便中虫卵的分离与鉴定 应用饱和盐水漂浮法检查C57BL/6 小鼠粪便,小鼠粪便中发现了两种形态的虫卵。其一,虫卵大小(116～130)μm×(28～38)μm,卵壳薄,两侧不对称,一侧较平直,一侧圆凸,似半月状(图1A)。其二,虫卵大小(87.5～90)μm×(34.5～41)μm,椭圆形,卵壳薄(图1B)。根据虫卵的形态,可确定小鼠至少感染两种寄生虫。

图1 两种虫卵的镜检形态

2.2 C57BL/6 小鼠肠道剖检观察 C57BL/6 小鼠剖解后,在盲肠和结肠发现感染程度不同的寄生虫,虫体数量因个体而异,严重者肠道中充满寄生虫,可见肠道出血,其他脏器未见明显病变。

2.3 疑似隐匿管状线虫形态学观察 小鼠盲肠发现的虫体均呈白色,线状,雌虫长3～5 mm(图2A)。成熟的雌虫,子宫内充满虫卵,口孔有唇瓣环绕,头泡发达程度存在个体差异,有一圆柱状食道,食道后连有发达的圆形食管球,阴门位于虫体的前1/6～1/5处(图2B)。未成熟雌虫观察,可清晰地看到子宫呈八字悬浮在腹腔后部(图2C)。雄虫虫体1～1.4 mm,泄殖孔后虫体急剧变细,尾尖细长。上述虫体与虫卵特征,初步判定为隐匿管状线虫。

图2 隐匿管状线虫的镜检形态

2.4 疑似四翼无刺线虫的形态学观察 在小鼠结肠发现的虫体均呈白色,线状,雌虫长2.5～4 mm(图3A)。口孔周围有3 片唇瓣环绕,有半椭圆形头泡,发达的宽颈翼,颈翼的起始位置为头泡中部,终止位置存在个体差异,多终止于食管球中部。有一棒状食道,食管球呈扁椭圆形(图3B)。阴门位于虫体的前1/3～1/2 处,可见U 形阴道(图3C)。成熟虫体,子宫中从阴门到肠道末段都充满虫卵,尾部呈圆锥形。雄虫体长略小于雌虫,头部与雌虫相似,尾部向腹部弯曲,可见宽尾翼,尾根呈圆锥形,无交合刺(图3D)。根据虫卵及虫体形态,可初步判断为四翼无刺线虫。

2.5 两种线虫的18S rDNA 基因片段的PCR 扩增结果 以通用引物对提取的两种寄生虫基因进行18S rDNA 基因的扩增,PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳,结果如图4 所示。由图4 可知,条带大小为850 bp 左右,与预期目的条带大小一致。

图3 四翼无刺线虫的镜检形态

图4 18S rDNA 基因PCR 扩增

2.6 18S rDNA 的测序比对分析 测序获得的2种18S rDNA 序列提交到NCBI 核酸数据库中,进行Blast 比对,结果表明扩增得到的基因序列分别与隐匿管状线虫和四翼无刺线虫的同源性达99%。

2.7 两种寄生虫的18S rDNA 遗传进化分析下载与两种线虫同源性较高的基因序列,使用MEGA7 软件制作遗传进化树(图5)。结果表明,分离的四翼无刺线虫与GenBank 登录号EF464551.1 的四翼无刺线虫同源性最高,隐匿管状线虫与GenBank 登录号EF464554.1 的隐匿管状线虫同源性最高。

图5 隐匿管状线虫和四翼无刺线虫的18S rDNA 序列进化树

3 讨论

线虫虫体、虫卵的大小、头部结构、食管球、尾部的形态特征以及外生殖器官的位置,经常被作为线虫的分类依据[4]。但寄生虫种类繁多,同一种线虫的发育状况存在着个体差异,部分虫卵的形态大小比较相近,所以有时仅依靠形态学鉴定难以做出准确判断。随着分子生物学的飞速发展,DNA 探针技术、PCR 技术等分子生物学技术广泛应用于寄生虫诊断中,不但提高了检测效率,而且可从基因水平上对寄生虫进行种属亲缘性鉴定和进化分析。18S rDNA 作为真核生物基因组的保守基因,已经广泛用于寄生虫的分类鉴定,是寄生虫学形态鉴定的重要补充。徐芬[5]利用18S rDNA 基因序列对索科线虫进行了系统发育分析。Sharmal 等[6]利用18S rDNA 的ITS 序列,对膜壳属的绦虫进行了鉴定。本试验利用18S rDNA 基因序列成功对两种线虫做出诊断。但Leblance 等[7]利用18S rDNA 的通用引物对蛲虫进行检测时,由于环境污染导致出现了假阳性结果。所以只有分子生物学和形态学观察两种方法相互结合验证,才能确保诊断的准确率。

本试验对患病小鼠的肠道进行了分段剖检,仅在盲肠段检出隐匿管状线虫,在结肠段检出四翼无刺线虫,说明此类寄生虫的寄生部位具有专一性,与之前报道一致。对分离到的两种线虫进行遗传进化分析,发现与本试验分离到的两种线虫同源性最高的隐匿管状线虫和四翼无刺线虫是在2007 年美国的小鼠中分离出的,说明两种线虫分布广泛,无地域分布特征。

两种线虫同为土源性寄生虫,发育周期短,感染20 d 左右,宿主粪便中可见虫卵。虫卵可在外界直接发育成感染期病原体,病原传播不需要中间宿主,一旦有小鼠感染,会迅速在群体中传播。此类寄生虫一旦感染,很难杜绝重复感染,所以对于寄生虫病的预防,一定要保持饲养室内外整洁无灰尘,严防饮水、饮食及垫料的污染及野鼠的出没。笼具、食具和出入厂区的人员要及时消毒,坚持每月小消毒,每季大消毒,规范养殖方式。鉴于该场房的感染情况,建议养殖场淘汰小鼠,更换垫料和饲料,降低饲养密度,对场区进行全面消毒后重新引种。