张 超,毕海林,肖裕章,袁启峰,胡 军,唐建华,

(1.重庆方通动物药业有限公司,重庆 荣昌402460;2.西南大学动物科学学院,重庆 荣昌 402460)

土霉素属于四环素类广谱抗生素,对革兰阳性和阴性细菌、立克次体、衣原体等都有抑制作用,由于具有良好的治疗效果,被广泛用于畜禽疾病的预防与治疗。在目前非洲市场土霉素注射液的需求量较大,价格合理且质量可靠的供应厂家并不多。虽国内报道了不同原料、浓度、溶媒的土霉素注射液的药代动力学特点[1-3],但在不同动物中的药动学参数必会有所差异。为此,本试验以山羊为靶动物,就不同厂家的土霉素注射液产品进行比较药代动力学试验,研究其在山羊体内药代动力学特征,从而为土霉素注射液在临床上合理使用提供依据和指导。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品 土霉素标准品(含量：89.5%,K0031208),购自中国食品药品检定研究院;A、D土霉素注射液,为国外某公司产品;B、E 土霉素注射液,为山东某公司产品;C 土霉素注射液,为重庆方通动物药业有限公司产品。草酸、高氯酸为分析纯试剂。甲醇、乙腈为色谱纯,水为屈臣氏纯净水。

1.2 仪器 高效液相色谱仪：Agilent1260,DAD 检测器,配备四元泵、脱气泵、色谱工作站、自动进样器和柱温箱(Agilent 公司,美国)。色谱柱：Uranus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司);涡旋混合器(上海青浦沪西仪器厂);高速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司);可调微量移液器10～100、1 000 μL(Eppendorf 公司)。

1.3 试验动物 重庆大足黑山羊,30 只,6～8 月龄左右,体重范围20～25 kg,自由采食、饮水,饲喂不含任何抗生素的日粮。

1.4 给药与采样 动物按随机分组。试验前测定制剂的含量,按照2010 版《兽药使用指南》制定剂量20 mg/kg·bw,分别颈部肌肉注射土霉素注射液。给药前采取空白血浆,给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、10、24、36、48、72、96 h,每次采血约3 mL,置于肝素钠抗凝管中,3 000 r/min 离心10 min,用移液器小心吸取血浆于1.5 mL EP 管中,每个样品保存2 份,置-20 ℃保存待测。

1.5 样品处理 取0.6 mL 血浆,加入200 μL 的沉淀剂(10% 高氯酸),漩涡30 s 混匀,静置后14 000 r/min 离心15 min,吸取上清液,经0.22 μm针式滤膜过滤,取滤液20 μL 进高效液相色谱分析。

1.6 色谱条件 流动相：0.01 mol/L 草酸溶液-甲醇-乙腈=75∶10∶15(V/V/V),色谱柱：C18 柱,进样量：20 μL,流速：1.0 mL/min,柱温：35 ℃,紫外检测波长：355 nm。

1.7 回收率和变异系数 将已知浓度的标准液加入山羊空白血浆中,配得低(0.5 μg/mL)、中(2 μg/mL)和高(5 μg/mL)3 个样品浓度,按1.5 样品处理方法处理样品,进行HPLC 测定;同时分别取浓度为0.5 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL 土霉素标准系列溶液进行HPLC 测定,不同浓度样品分别重复5次,以峰面积比计算,求其回收率。每批(日内)作5 次重复,共作5 个批次(日间)。计算每批内和每批间的色谱峰面积平均值及标准误,求得各变异系数。

1.8 标准曲线和线性范围 在1.5 mL 的离心管中各加入0.6 mL 空白血浆,再依次加入土霉素系列浓度(1～50 μg/mL),旋涡混匀,使得各样品中血浆的药物浓度为0.2～10 μg/mL(按1.5 样品处理方法处理样品,进行HPLC 测定。以土霉素色谱峰面积为横坐标(A),药物浓度(B)为纵坐标,绘制标准曲线,求得标准曲线回归方程和相关系数。

1.9 样品测定与数据处理 给药后不同时间点采集血浆样品经处理后,进行HPLC 测定,药时曲线图采用GraphPad Prism 5 绘制;药物动力学模型拟合采用3P97 药代动力学软件处理,采用Marquardt 法以权重1,1/C,1/C23 种进行曲线拟合,根据WSS和AIC 值判断最佳药代动力学模型。采用SPSS 20对血药浓度和药动学参数进行方差分析。其他相关参数和方程计算根据《生物药剂学和药物动力学》所列公式计算。

2 结果

2.1 色谱条件适用性 在本试验色谱条件下,土霉素与其他组分分离良好,色谱峰峰形较佳,测得土霉素保留时间为7.2 min(见图1)。

2.2 回收率和变异系数 按上述样品处理方法,在0.2、1、5 μg/mL 浓度下,平均回收率在(74.6±2.3)%～(81.5±3.1)% 之间,批内和批间系数均不超过10.0%。由此可知,此血浆处理方法用液相检测方法可靠,重复性好。

2.3 标准曲线和线性范围 血浆中土霉素线性回归方程为Y=26.52X-1.477(R=0.999 9),线性范围为0.1～10 μg/mL,按信噪比S/N=3 为检测限(LOD),S/N=10 为定量限(LOQ),求得本方法测定血浆中土霉素检测限为0.03 μg/mL,定量限为0.1 μg/mL。

2.4 血药浓度和主要药动学参数 土霉素注射液在山羊体内符合一级吸收二室模型,土霉素注射液药动学的血药浓度时间曲线和主要药动学参数见封三图2 和表1。

图1 土霉素专属性高效液相色谱图

图2 山羊单剂量肌肉注射不同品种土霉素注射液后药时曲线

表1 山羊单剂量注射土霉素注射液后主要药动学参数比较

3 讨论

试验前查看文献报道[4-5]土霉素注射液的流动相,并根据条件比较选择不同流动相,最终选定草酸溶液-乙腈-甲醇作为流动相。由于土霉素微溶于水,而流动相中必须含有有机溶剂,为了获得较好的柱效和保留时间,需选择酸性溶剂这样可以减少土霉素中化学基团在离子键、化学键等作用导致的峰拖尾,并且在酸性环境中能有效抑制色谱柱中十八烷基硅烷键合硅胶中的硅羟基离子化,减少离子间相互作用,有助于土霉素分离、形成良好峰型。最终确定流动相为：0.01 mol/L 草酸溶液-甲醇-乙腈=75∶10∶15。

土霉素注射液的处方和工艺,国内外有多种版本,有用单一溶剂作溶媒的,也有用复合溶剂做溶媒的,产品在稳定性和疗效上也存在一些差异,本试验通过市场上不同浓度的土霉素注射液来比较其差异。结果显示,高浓度(20%)土霉素注射液具有半衰期长,峰浓度高,药时曲线下面积大等特点,与低浓度(10%)土霉素注射液之间差异显著;在相同剂量下,不同厂家的土霉素注射液在山羊体内的药动学特征可能与药物中的辅料和用量不同有关。由于不同厂家在考虑配方的稳定性、抗氧化性等方面,使用不同的有机溶媒(聚乙烯吡咯烷酮、α-吡咯烷酮、丙二醇等),导致对土霉素注射液的药动学参数也会有所影响,徐士新等[8]也证实有机溶媒对药动学参数的影响。在相同浓度规格(10% 或20%)土霉素注射液下,从达峰时间、达峰浓度、药时曲线下面积可以看出在山羊体内的过程具有相似的药动学特征;表明在相同药物浓度下,相同浓度规格制剂在配方设计中为保证药物的稳定性,使用的有机溶媒用量几乎一致,从而使两者具有相似的药动学特征。

如今,安全用药是人们关注的焦点,要达到用药安全必须对药物进行动力学试验,在《兽药管理条例》中对兽药申报尤其是新兽药和兽药新剂型的申报提出了提交的药代动力学参数要求,所以我们有必要对不同品种的药物进行动力学研究[6]。此研究不同品种土霉素注射液在山羊体内均符合一级吸收二室模型,与廖雪玲等[7]报道一致。因此在使用不同品种的药物时要充分了解药物的在体内的性质特征,从而能充分发挥药物本身的作用,发挥药效。