王志浩,颜 硕,王昱璎,刘宝涛

(青岛农业大学动物医学院,山东 青岛 266109)

大肠杆菌(Escherichia coli),是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希菌属(Escherichia)的代表菌[1]。鸡大肠杆菌病是由大肠杆菌(E.coli)中的某些致病性菌株所导致的多种疾病的总称,多采用抗生素类药物治疗[2]。抗菌药常在兽医临床中疾病的治疗、预防与促进生长等方面使用,由于长期使用抗生素,使得动物正常菌群的耐药率不断上升[3]。超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)主要产生于大肠杆菌和克雷伯氏菌属,可水解3 代头孢菌素和单环酰胺酶类药物,并被BIA 抑制剂(如舒巴坦)所抑制[4]。ESBLs 根据基因同源性的不同,目前可分为5 类：TEM 型、SHV 型、CTX-M 型、OXA 型和其他类型等[5-6],目前我国主要流行型为CTX-M 型。磷霉素主要用于治疗人金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等引起的软组织感染和单纯性尿路感染。Bartoloni[7]等在南美地区分离得到170 株大肠杆菌,其磷霉素耐药率为98.2%,由于磷霉素在我国临床应用时间相对国外较短,目前对兽医领域磷霉素及其耐药基因流行性的相关报道较少。本研究调查了山东地区鸡源大肠杆菌的耐药情况及ESBLs和磷霉素耐药基因的携带情况,为鸡临床用药提供科学依据,也为预防和减少耐药的出现提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品的采集 2015-2016 年在山东青岛、临沂、威海、烟台、潍坊等各个地区的养殖场、活禽交易市场采集鸡泄殖腔拭子336 份。

1.2 主要试剂 细菌生化微量鉴定管,购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;Taq 酶、Marker,购自TaKaRa 试剂公司;头孢噻肟(CTX)、头孢噻呋(CTF)、氨苄西林(AMP)、氟苯尼考(FFL)、多西环素(DOX)、四环素(TET)、庆大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、链霉素(STR)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、左氧氟沙星(LEV)、萘啶酸(NAL)和磷霉素(FOS)等药敏试验药物,购自上海麦克林试剂公司;麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、LB 琼脂和LB 肉汤,购自北京陆桥生物技术有限责任公司。

1.3 细菌的分离鉴定 将样品接种于LB 肉汤,培养过夜。并接种于麦康凯琼脂,放入恒温培养箱中36 ℃±1 ℃培养18～24 h,并进行纯化;挑取纯化后的可疑单菌落进行革兰染色和生化鉴定。

1.4 药敏试验 按照美国临床和实验室标准协会(CLSI,2015)规定的琼脂稀释法测定菌株对14 种抗菌药的敏感性,并根据CLSI 中耐药折点进行耐药判读。

1.5 ESBLs 基因型及磷霉素耐药基因检测 通过水煮法提取DNA,根据Liu[8]报道的blaCTX-M-1G引物序列,Briñas[9]报道的blaCTX-M-9G引物序列和Hou[10]报道的磷霉素耐药基因fosA3、fosC2 和fosA及PCR反应体系进行耐药基因检测：水18.375 μL,PCR Buffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,上下游引物各0.5 μL,模板DNA 1 μL,Taq0.125 μL。扩增条件为：95℃预变性5 min,(95 ℃,30 s+55 ℃,30 s+72 ℃,30 s)×30 个循环,再延伸5 min。扩增完毕后用1%琼脂糖电泳,在凝胶成像系统上观察电泳结果。经电泳鉴定的PCR 产物送至华大基因科技服务有限公司测序,并进行序列同源性分析。

2 结果

2.1 细菌的分离鉴定结果 采集的336 个泄殖腔拭子中,经鉴定共获得336 株大肠杆菌,其中蛋鸡源153 株,肉鸡源183 株。

2.2 药敏试验结果 336 株大肠杆菌对四环素、氨苄西林和多西环素的耐药率较高,均达到78%以上,分别为85.4%、82.7%和78.6%,其余依次是萘啶酸(72.6%)、氟苯尼考(67.0%)、链霉素(56.0%)、恩诺沙星(50.0%)、头孢噻肟(44.9%)、卡那霉素(40.2%)、头孢噻呋(38.4%)、环丙沙星(37.8%)、庆大霉素(25.6%)、左氧氟沙星(26.8%)和磷霉素(28.7%)。336 株大肠杆菌中,肉鸡源大肠杆菌对除氟苯尼考外的13种药物的耐药率均显著高于蛋鸡源大肠杆菌的耐药率(P＜0.05),详见图1。

图1 不同来源鸡源大肠杆菌对14 种抗菌药物的耐药率

2.3 ESBLs 基因及磷霉素耐药基因PCR 结果 在336 株大肠杆菌中,123 株(36.6%)携带blaCTX-M型ESBLs,携带率最高的为blaCTX-M-9G(24.1%,81 株),其次为blaCTX-M-1G(15.5%,52 株),其中10 株同时携带blaCTX-M-9G和blaCTX-M-1G基因,其他基因型ESBLs均未检测出。在肉鸡源大肠杆菌中blaCTX-M-9G携带率为33.9%,blaCTX-M-1G携带率为20.8%,其中包括10 株同时携带blaCTX-M-9G和blaCTX-M-1G基因的菌株;蛋鸡源大肠杆菌中blaCTX-M-9G携带率为12.4%,blaCTX-M-1G为9.2%;值得注意的是,肉鸡源大肠杆菌CTX-M 型ESBLs 携带率(49.2%)显著高于蛋鸡源大肠杆菌CTX-M 型ESBLs 携带率(21.6%)(P＜0.01),具体见表1。336 株大肠杆菌中fosA3 基因携带率为21.7%,fosA和fosC2 均未检测出,并发现肉鸡源大肠杆菌fosA3 检出率(27.9%),显著高于蛋鸡源大肠杆菌fosA3 的检出率(14.4%)(P＜0.01),具体见表2。值得注意的是,在123 株产CTX-M 型ESBLs大肠杆菌中,有66 株(53.7%)同时携带fosA3,显著高于非产ESBLs 大肠杆菌中fosA3 的携带率

(3.3%)(P＜0.01)。

表1 336 株大肠杆菌中ESBLs 基因检测结果

表2 336 株大肠杆菌中磷霉素耐药基因结果

3 讨论

大肠杆菌是人和动物体内肠道的共生菌,可作为一些可转移耐药质粒的重要储存库[11]。在各种可移动元件携带的耐药基因中,ESBLs 能水解作为目前人类临床和兽医临床的常用药和关键药的第三、第四代头孢菌素,它的出现和散播引起了广泛注意[12]。其中从猪肛门内和禽泄殖腔中分离到的产ESBLs 大肠杆菌报道较多,产ESBLs 菌株不仅对氟喹诺酮类、头孢菌素类药物表现出较高耐药率而且对多种抗菌药均表现出交叉耐药和多重耐药[13]。当今,产ESBLs 的大肠杆菌不断增多,耐药日益严重,其已成为人类研究的重要课题。磷霉素主要用于治疗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌等引起的软组织感染和单纯性尿路感染,目前未用于动物疾病的治疗,但是鸡源大肠杆菌内却存在磷霉素耐药基因,因此对鸡源大肠杆菌进行磷霉素耐药基因调查格外重要。

随着养禽业不断发展,禽源大肠杆菌的耐药率与日俱增。本试验对山东地区鸡源大肠,杆菌对14种常用抗菌药进行耐药检测,结果表明,山东地区鸡源大肠杆菌对氨苄西林、氟苯尼考、多西环素、四环素和萘啶酸的耐药率均在67%以上,对头孢菌素类药物的耐药率已经高达38.4%～44.9%;对氟喹诺酮类药物的耐药率在26.8%～50.0%。王慧真[14]等报道的河北地区鸡源大肠杆菌对头孢菌素类药物耐药率为41%～70%,氟喹诺酮类为58%～70%,氨基糖苷类为33%～70%;李赫[15]报道的辽宁省盘锦地区动物源大肠杆菌对头孢菌素类药物耐药率为37%～52%,喹诺酮类为33%～89%,氨基糖苷类为48%～89%;本试验结果与其他地区这些已有报道相一致,表明我国禽源大肠杆菌耐药十分严重。2013 年,Hou[16]等将从广东养殖场分离的892 株鸡源大肠杆菌进行磷霉素耐药率检测,其耐药率为1.3%,显著低于本研究2015-2016 年的鸡源大肠杆菌的耐药率(28.7%),这说明磷霉素耐药在近年来呈上升趋势。本研究发现,蛋鸡源大肠杆菌对各种药物(氟苯尼考除外)的耐药率均显著低于肉鸡源大肠杆菌的耐药率,分析其原因可能是由于肉鸡的养殖周期短密度大,易发生细菌性疾病,使肉鸡饲养中抗菌药的使用剂量及频率明显高于蛋鸡所致。因此,肉禽生产中抗菌药使用的监管力度亟待加强。

ESBLs 基因型中最早报道的为TEM 型,但在近年来国内外报道的动物源大肠杆菌中ESBLs 的主要流行型为CTX-M 型[17],如香港Ho[11]等和英国Horton[18]等报道的动物源产ESBLs 大肠杆菌中,CTX-M 型的携带率均超过90%。我国谢榕[19]等报道在河北地区鸡源大肠杆菌中CTX-M 型ESBLs 的携带率为66.3%,刘保光等[20]报道鸭源大肠杆菌ESBLs 的检出率为33.0%,本研究在山东地区检测CTX-M 型ESBLs 携带率为36.6%。这说明在不同地区和不同动物源大肠杆菌中产ESBLs 的阳性率存在差异。Hou[16]等将从广东养殖场分离的892株鸡源大肠杆菌进行磷霉素耐药率检测,最终得到12 株(1.3%)耐磷霉素大肠杆菌,其中10 株存在fosA3 基因(1.1%);本研究中336 株大肠杆菌中fo-sA3 基因携带率为21.7%,明显高于广东地区,其可能原因为本研究所用菌株分离自2015-2016 年且随着年代的变化磷霉素耐药发生扩散导致。研究还发现fosA3 基因对磷霉素的耐药率起重要决定作用。本研究显示,山东地区肉鸡源大肠杆菌中fosA3和CTX-M 型ESBLs 的检出率均显著高于蛋鸡源大肠杆菌(P＜0.01),其原因可能为肉禽养殖规模大,养殖时间短,为防止疾病的发生而使用抗生素造成的。值得注意的是,fosA3 在产CTX-M 型ESBLs 大肠杆菌中的携带率(53.7%)显著高于非产ESBLs大肠杆菌中的携带率(3.3%)(P＜0.01),这说明fosA3 与CTX-M 型ESBLs 联系密切,且随着头孢菌素类药物在养禽中的应用可促进磷霉素耐药的传播。近年来,由产ESBLs 的肠杆菌和氟喹诺酮耐药大肠杆菌引起的人尿路感染越来越多,这使磷霉素这一“老药”成为治疗该感染的有效药物。兽医临床使用广谱抗生素,产生的携带ESBLs 和磷霉素耐药基因的菌株会通过直接接触或食物链等方式进入人体,给尿路感染的治疗等带来巨大难题,对此我们应给予重视。本研究获得的耐药率和耐药基因结果,可为养鸡场细菌性疾病的用药提供理论指导。