张勇军,巫辅达,徐志高,巴 娟,邓 桦,杨 鸿

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东 佛山 528231)

黄芪是一味大宗药材,最早被记载于中医四大经典著作《神农本草经》[1-2]。黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)是黄芪的主要有效成分,具有广泛药理活性,包括调节心血管、增强免疫、抗病毒、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射等作用[3-5]。目前大部分传统中药多糖制剂存在着稳定性差、生物利用度低、易被降解及对细胞穿透力弱等缺点,影响了中药多糖药效的发挥。脂质体是一类具有靶向特定给药、缓慢释放、提高药效与药物稳定性、降低药物不良反应的优点,近年来已被广泛研究应用作为药物的载体,中药脂质体制剂的研制成为中药制剂研究的热点[6-9]。因此开展黄芪多糖脂质体制备方法及表征研究,对提高中药多糖制剂的生物利用度、治疗效果、降低使用剂量等有重要临床意义,对中药多糖新制剂的研发具有积极推动作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 大豆卵磷脂(合肥博美生物科技有限公司,批号：DP4711);胆固醇(合肥博美生物科技有限公司,批号DC1212)。

1.1.2 主要仪器 RE-201D 旋转蒸发仪(郑州予华仪器制造有限公司);UV-6000 型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);MS-H-Pro+磁力搅拌器(大龙兴创实验仪器有限公司);HN1012 超声波清洗机(广州市华南超声设备有限公司);FEI Technai G2 F20 型透射电子显微镜(Philips 公司);纳米颗粒分析仪SZ-100Z(日本HORIBA 公司);真空冷冻干燥机(美国LABCONCO 公司)。

1.2 方法

1.2.1 多糖的制备 采用正交试验优选出的水提醇沉方法进行提取,以苯酚-浓硫酸法测定其多糖含量。多糖提取最佳工艺：料液比1∶16、浸提温度90 ℃、浸提时间90 min、提取次数3 次,纱布过滤,沉淀完全后,取上清液抽滤,滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩,加无水乙醇沉淀12 h,沉淀物经大孔树脂纯化,真空冷冻干燥,即得黄芪多糖。经测定黄芪多糖平均质量分数57.79 %。

1.2.2 检测波长的确定 精密吸取25 mg/L 葡萄糖对照品溶液2 mL,加入5 %苯酚溶液1 mL,混匀,加入浓硫酸5 mL,混匀,沸水浴15 min,冷水浴5 min,以蒸馏水为空白对照,在200～800 nm 范围内扫描,在490 nm 处出现最大吸收。空白脂质体A在此处无吸收,故选择检测波长490 nm。

1.2.3 脂质体的制备 采用逆向蒸发法[10]：将一定比例的大豆卵磷脂和胆固醇溶于氯仿,采用旋转蒸发仪进行减压旋转蒸发,使圆底烧瓶内壁形成一层半透明的淡黄色脂质薄膜,加入乙醚将薄膜溶解,加入适量黄芪多糖浓度10 mg/mL 磷酸盐缓冲溶液(pH 值=7.4),进行充分混匀,在一定的超声功率和时间下超声混匀,置于旋转蒸发仪上减压抽吸至乙醚挥发完全,即得到乳白色的APS 脂质体悬液,4 ℃保存备用。

1.2.4 脂质体包封率的测定

1.2.4.1 标准曲线绘制 精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品100 mg,置100 mL 容量瓶中,加蒸馏水溶解并定容至刻度,即得1 mg/mL 的储备液,从中吸取10 mL 置100 mL 容量瓶中,加水稀释至刻度,即得0.1 mg/mL 的标准液。分别吸取标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 至比色管中加蒸馏水适量至2 mL,再各加入5 %苯酚溶液1 mL,混匀,加入浓硫酸5 mL,混匀,沸水浴15 min,冷水浴5 min,在490 nm 处测定吸光度。以葡萄糖浓度(C)对吸光度(A)进行回归,得回归方程Y=65.078X+0.324 4,R2=0.999 8,结果表明葡萄糖在2.5～12.5 μg/mL 之间线性关系良好。

1.2.4.2 精密度试验 吸取相同质量浓度黄芪多糖溶液,以蒸馏水为空白对照,于490 nm 处测量其吸光度(n=5)。吸光度值RSD 为0.35%,表明本试验所用仪器具有良好的精密度。

1.2.4.3 稳定性试验 吸取相同质量浓度黄芪多糖溶液,分别于0,30,60,90,120,150,180 min 在490 nm 处测定其吸光度。经测定多糖溶液在3 h 内的吸光度值RSD 为0.43%,表明多糖溶液的稳定性良好。

1.2.4.4 加样回收率试验 精密称取葡萄糖标准品溶液,分别配置成高、中、低3 个质量浓度,加入适量空白脂质体,于490 nm 处测定其吸光度值。经测定平均加样回收率为99.56%,RSD 为3.36%。

1.2.4.5 包封率测定 采用超速离心法测定[11]：吸取2 mL 脂质体至离心管中,以10 000 r/min 冷冻离心30 min,吸取上清液1 mL,加入蒸馏水将其定容至50 mL,采用苯酚-浓硫酸法测定其多糖含量,在490 nm 处测定吸光度,计算其上清液中游离多糖浓度。按下公式计算包封率：

包封率=(W总-W游)/W总×100%

W总为总投入的药物量,W游为游离的药物量。

1.2.5 制备工艺设计 在前期预试验的基础上,对各项因素进行考察,逐步筛选出对脂质体包封率影响较大的3 个因素作为考察对象,即膜材比(大豆卵磷脂与胆固醇质量比)、脂药比(大豆卵磷脂与药物质量比)和超声时间对脂质体的制备影响最大。因此,以膜材比(A)、脂药比(B)和超声时间(C)为考察因素,按L9(34)正交表安排试验。因素水平见表1。

表1 因素水平

1.2.6 体外释药试验 制备相同质量浓度黄芪多糖PBS 溶液(pH 值7.4),取两者各5 mL 于处理好的透析袋中,浸入200 mL PBS 溶液(pH 值7.4)释放介质,于100 r/min、(37±0.5)℃下恒温磁力搅拌,于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h 吸取1.0 mL 透析液,同时补加同温等量释放介质。加水稀释透析液,测定吸光度,计算累积释放率,绘制体外释放曲线。

1.2.7 脂质体形态及粒径测定 吸取适量脂质体混悬液于铜网上,待悬液干燥后,以2%磷酸钨水溶液滴到碳膜上进行负染。待负染液干燥后置透射电镜下观察。脂质体采用水当做分散介质,通过纳米颗粒分析仪测量其粒径分布情况及其平均大小。

2 结果

2.1 正交试验结果分析 根据正交试验结果分析得知,以包封率为指标,对各因素影响的大小为脂药比(B)＞膜材比(A)＞超声时间(C),其最佳制备工艺为A3B1C1。因此,优选出最佳脂药比4∶1,最佳膜材比8∶1。根据方差分析,进行F 检验,可知超声时间对脂质体的包封率影响较小,从实现工厂化生产考虑,生产规模大,膜材与药物之间可能混合不均匀,为了更好提高脂质体的包封率,因此选择超声时间90 s 较好。正交试验结果见表2,方差分析结果见表3。

表2 L9(34)正交试验结果

表3 方差分析

2.2 体外释药试验结果 由中插彩版图1 可知,黄芪多糖脂质体比多糖溶液释药率明显减小。在4 h 时,多糖溶液释放率达到69.21%,在8 h 时已基本达到释放完全;脂质体在4 h、8 h 时累积释放率分别为 48.09%、55.13%,24 h 时 达 到62.67%,表明制备的黄芪多糖脂质体具有一定的缓释作用。

图1 体外释放曲线

2.3 脂质体形态及粒径测定 由图2 和图3 可知,透射电镜下观察,黄芪多糖脂质体粒径较均匀,形态良好,呈椭圆形或圆球形,脂质体可见明显的双层膜结构,平均粒径在557 nm。

图2 APS 脂质体透射电镜图

图3 脂质体的粒径分布

3 讨论

近年来,国内外对脂质体制备的研究方法主要有注入法、熔融法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法、冷冻干燥法、高压乳匀法、表面活性剂增溶法以及采用多种方法联合制备等[12]。逆向蒸发法适合生物大分子与水溶性药物脂质体的制备,此方法得到的脂质体包封率较高,且制备方法简单、工艺可行。

包封率是指在脂质体中被包封的药量占加入总药量的百分比。可作为脂质体内在质量好坏的评价指标。目前脂质体包封率的测定方法主要有透析法、葡聚糖凝胶柱色谱法、超滤膜滤过法、鱼精蛋白凝聚法等,以上测定方法均有其局限性[13]。透析法需不断更换透析液,且消耗时间长;葡聚糖凝胶柱色谱法需大量洗脱液,操作比较繁琐;超滤膜滤过法需较好的超滤管膜,适合水溶性药物的测定;鱼精蛋白凝聚法适合于带正电荷或小分子药物的测定。采用超速离心法测定包封率,分离速度快,分离效果较好,操作简单[14]。

一般认为提高脂药比可增大脂质体的包封率。本试验表明,在膜材比相同的条件下,随着脂药比的增大包封率未出现显著增大,反而出现包封率下降的情况[1]。可能由于膜材的比例太低无法达到完全包封药物的条件,因此导致药脂比与包封率成反比。

体外释药试验表明,与黄芪多糖溶液相比,黄芪多糖脂质体外释药率明显减小,说明黄芪多糖脂质体具有一定的缓释作用。

制备黄芪多糖脂质体的最佳工艺为膜材比8∶1,脂药比4∶1,超声时间90 s,包封率93.77 %,且具有较高的包封率和良好的缓释作用,脂质体为乳白色悬液,其形态为椭圆形或圆球形,双层膜结构,平均粒径在557 nm,说明脂质体作为黄芪多糖载体是可行的。