曾紫雄,高 尚,鞠辉明,张信军,成大荣,杨跃飞,王彦红

(1.扬州大学兽医学院,江苏 扬州225009;2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州 225009)

溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)原名溶血性巴氏杆菌(Pasteurella haemolytica),常存在于牛羊的鼻咽部,可致牛和绵羊肺炎、新生羔羊败血症、羊乳腺炎等疾病,在全球都有分布,对牛、羊养殖业危害大[1-2]。其主要的毒力因子有白细胞毒素,此外菌毛、荚膜多糖、唾液酸糖蛋白酶、外膜蛋白和脂多糖也参与致病作用[2]。在溶血性曼氏杆菌12个已确定的荚膜血清型(1、2、5、6、7、8、9、12、13、14、16和17 型)中,1 型、2 型和6 型是全世界最普遍的[3-5]。本研究从江苏两地养殖场的山羊肺炎病例中先后分离出2 株溶血性曼氏杆菌,对分离菌的血清型进行鉴定,同时采用多位点序列分型法获取2 株细菌的ST 型,以分析该菌在本地区流行特点。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2017 年7 月南通海安一养殖户饲喂的300 只山羊,日龄105 d,发病30 只,死亡20只,送检2 只。对送检的2 只病羊剖检,1 只肺尖叶、心叶完全实变,肝土黄色、胆囊充盈,腿有1 个直径2～3 cm 化脓灶;另1 只肺瘀血,表面有较多渗出物。取病羊的肝脏、肺脏的病变组织进行细菌的分离鉴定。2018 年2 月扬州仪征一养殖户的本地山羊和波尔山羊杂交种,8～10 个月龄,死亡10 多只,送检1 只,已病15 d,期间用氟苯尼考注射用药,口腔溃疡,口服用药较多。病理剖检肺尖叶、心叶肉变,心包膜胶冻样水肿,心肌苍白。胆囊充盈,小肠充血,肠黏膜出血,有少量白色结节。球虫检查为阳性。

1.2 细菌分离 无菌操作取病羊的肝脏、肺脏的病变组织接种于血琼脂平板上,于温箱中37 ℃培养24 h 后挑取血琼脂平板上的单个菌落,分别接种于血琼脂平板和麦康凯平板上,37 ℃温箱培养24 h,观察生长情况。挑取单个菌落,涂布,革兰染色镜检。

1.3 生化试验 采用细菌微量生化反应管(购自杭州天和微生物试剂有限公司),对所分离的菌株进行生化指标测定,最后放置于37 ℃温箱中培养。培养时间及判定标准严格参照产品使用说明书。

1.4 16S rDNA 序列鉴定 采用煮沸裂解法制备分离株的细菌基因组DNA 模板,按照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 方法(宝生物工程(大连)有限公司)操作,PCR 扩增,经1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定,预期条带长度约为500 bp。PCR 阳性产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。将测定的序列在NCBI 网站(http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST)进行BLAST 搜索比对,鉴定细菌种属。

1.5 PCR 鉴定血清型 根据Cassidy L K 等人[6]的研究方法采用PCR 方法依次区分鉴定2 株分离菌的血清型1 型、2 型和6 型,溶血性曼氏杆菌血清型1 型、2 型和6 型对应的目的基因、引物以及引物扩增长度如表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 扩增反应总体积为25 μL,包括0.2 μLTaq酶、2.5 μL 10×Buffer、0.5 μL dDTP、2 μL DNA 模板、0.2 μL 的上下游引物以及19.4 μL 超纯水。PCR 循环条件为96 ℃预变性5 min,96 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30 个循环,末轮循环结束,72 ℃延伸10 min。经1%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳鉴定分离菌的血清型。

表1 PCR 鉴定血清型扩增的目的基因、所需引物以及引物扩增长度

1.6 MLST 根据MLST 网站中的溶血性曼氏杆菌信息库(http：//pubmlst.org/mhaemolytica/)获取7个管家基因和MLST 分析中的PCR 信息、引物信息以及扩增序列的长度(表2)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 扩增反应总体积为25 μL,包括0.2 μLTaq酶、2.5 μL10×Buffer、0.5 μL d DTP、2 μL DNA 模板、0.2 μL 的上下游引物以及19.4 μL 超纯水。PCR 扩增反应循环条件为96 ℃预变性5 min,96 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30 个循环,末轮循环结束后72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物经1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 阳性产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序,将2 株分离菌的7 个管家基因测序结果上传至数据库(http：//pubmlst.org/mhaemolytica/)搜索比对。

表2 管家基因、引物序列及扩增引物长度

1.7 药敏试验 通过纸片扩散试验检测细菌对抗菌药物的敏感性,将各种抗菌药物圆纸片分别贴于培养基表面。37 ℃培养24 h 观察结果。抗菌药物纸片(购自杭州天和微生物试剂有限公司),所含药物分别有庆大霉素、左氧氟沙星、链霉素、卡那霉素、多黏菌素B、氟苯尼考、新霉素、诺氟沙星、多西环素、美洛西林、妥布霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星、阿莫西林、头孢哌酮、头孢噻肟,含量及敏感性判定标准如表3。

2 结果

2.1 细菌分离 对剖检病料分离细菌并纯化得到2 株细菌,分别命名为MH1、MH2。2 株分离菌在血琼脂平板上生长良好,并有明显的溶血现象,在麦康凯培养基上不生长。革兰染色镜检发现2 株分离菌均为革兰阴性短杆菌,两端钝圆,单个或散在排列。

2.2 生化试验 2 株分离菌均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类,发酵甘露醇,不发酵甘露糖,氧化酶阳性,尿酶阴性,此生化结果符合溶血性曼氏杆菌的生化反应特点。

2.3 16S rDNA 基因序列鉴定 将测定的序列上传至NCBI 网站进行BLAST 搜索比对,结果表明,所获得的序列与已公布的溶血性曼氏杆菌16S rRNA 基因部分序列(AF060699.1)的同源性为99%。

2.4 血清型和MLST 2 株分离菌经血清型鉴定PCR 后,电泳出现约160 bp 条带,故为血清型2 型。将2 株分离菌的7 个管家基因测序结果上传至数据库(http：//pubmlst.org/mhaemolytica/)搜索比对,得到的结果是2 株细菌的7 个管家基因的等位基因adk、aroE、deoD、gapDH、gnd、mdh和zwf的序号分别为1、1、3、1、1、1 和4,序列型一致,均是ST46。

图1 PCR 血清型鉴定结果

图2 7 个管家基因PCR 检测结果

2.5 药敏试验 2 株细菌药敏试验结果见表3。MH1 对链霉素耐药,对多西环素和妥布霉素中介,对其他13 种药物均敏感;MH2 对链霉素中介,对其他15 种药物均敏感。

3 讨论

根据送检羊剖检症状、细菌分离培养特点、镜检结果、生化特征及16S rDNA 序列鉴定结果,表明从送检羊中分离出的2 株细菌为溶血性曼氏杆菌。溶血性曼氏杆菌是导致羊的鼻咽部等呼吸道疾病的常见菌,可引起羊肺炎、新生羔羊败血症、羊乳腺炎等疾病,在全球都有分布,对羊养殖业危害大[1-2]。根据文献报道,羊源溶血性曼氏杆菌荚膜血清型多为2 型[4-5],本次分离菌的血型也为2 型,与研究报道一致。

多位点序列分型法(multilocus sequence typing,MLST)是通过测序技术来揭示管家基因中的等位基因的变异情况,从而对病原微生物分型和鉴定的方法[7]。在MLST 方法中,对某一菌株每个管家基因的所有等位基因都按发现的先后顺序分配一个等位基因序号(allele number),把该菌株所有管家基因的每个等位基因合并在一起组成一个等位基因谱(allelic profile),并给这个等位基因谱分配一个唯一的编号作为该分离株的核酸型或序列型(Sequence type,ST)[7]。由于管家基因几乎都存在一定的保守性,而不同的菌株间又存在一定的差异,这些差异可以使得细菌的生长发育和新陈代谢产生不同,故通过MLST 对管家基因的分析可以准确记录细菌基因水平上的变异[8-9]。它还可以通过互联网识别和追踪病原菌,使分型的数据在全球各实验室之间得以交换,为分子流行病学的研究提供了一种新的方法[10]。在此次研究中,2 株分离菌ST 均为46,此基因型是一个新的ST 型,目前在江苏地区分离出此基因型,补充了溶血性曼氏杆菌的数据库,并为进一步的细菌分子流行病学研究奠定了基础。

目前使用抗生素仍是治疗感染溶血性曼氏杆菌病例的主要手段,故细菌的耐药性在临床上需要重点关注。此前,黄宇[11]等人对广西的1 株溶血性曼氏杆菌进行耐药性分析,结果显示,细菌对复方新诺明、多粘菌素B、卡那霉素、青霉素G 和氨苄西林表现为耐药;李娟[1]等人对江苏的1 株溶血性曼氏杆菌进行耐药性分析,结果显示,对四环素、链霉素、磺胺嘧啶、大环内脂类和磺胺二甲基嘧啶等存在耐药性。本次研究中也出现了1 株细菌对链霉素耐药的情况。因此,建议避免盲目滥用、长期使用同种抗菌药物,结合分离鉴定到的病原的药敏试验结果有针对性的用药。除此之外,加强畜舍的卫生通风管理,减少应激不失为良好的辅助预防和治疗溶血性曼氏杆菌病的措施。

表3 2 株溶血性曼氏杆菌药敏试验结果