焦瑞莲，任毓忠，李国英*，张莉*，张国丽

（1.石河子大学农学院/ 新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室，新疆石河子832003；2.新疆农垦科学院生物技术研究所，新疆石河子832000）

枝孢属Cladosporium是丝孢纲异质性很强的属之一。由于该属真菌对环境具有较强的适应性，如耐渗透性、耐盐性、耐热性和嗜冷性等[1-2]，其分布广泛，经常从土壤、食物、油漆、纺织品和其他基质中分离得到。它们也被认为是常见的内生真菌[3-4]，大多数腐生，有些为植物次生侵染真菌，可引起叶斑、叶霉、果腐、茎腐、纺织品腐败及木材腐朽，使农产品遭受严重损失，少数枝孢菌还可引起人畜疾病。

枝孢菌种的形态特征易受到环境影响，不同种枝孢菌的形态特征常具有相似性，因此，一些常见种常被认为是复合种，如枝状枝孢 （C.cladosporioides）、球孢枝孢（C.sphaerospermum）和多主枝孢（C.herbarum）等[5]，故国际真菌分类委员会认为枝孢菌是迫切需要进行分类鉴定的真菌。Braun 等于2003 年首次使用核糖体DNA 内转录间隔区（rDNA internal transcribed spacer，rDNA-ITS） 序列引物对枝孢属进行了分子鉴定，结果表明，rDNA-ITS 引物可用于属间鉴定，但对枝孢属内种的鉴定效果不理想[6]。Schubert 等发现多位点DNA 序列分析方法，即基于rDNA-ITS、肌动蛋白 （Actin，ACT）、 翻译延长因子 1-α（Translation elongation factor 1-α，TEF1-α） 序列分析可更好区分一些关系紧密的类群，这为枝孢菌分子生物学鉴定奠定了基础[7]。随后，Bensch 等于2012 年通过形态学特征并结合分子生物学的方法对枝孢属进行了重新鉴定和分类，其中，有169 个枝孢菌确定了分类地位[1]。目前，在枝孢属中已确认约200 个种[1,8-9]。

国内外关于棉花枝孢菌病害的报道很少，1929 年Jaczewski 将分离自棉花纤维上的枝孢菌命名为棉枝孢（C.gossypii）；Pidoplichko 和 Deniak 于1953 年将分离自乌兹别克斯坦棉花种子上的枝孢菌命名为棉生枝孢（C.gossypiicola），他们还于1959 年将分离自克里米亚棉花种子上的枝孢菌命名为棉生枝孢小型变种 （C.gossypiicolavar.minor），这是因其分生孢子较小[10-11]；此外，1967 年Gonen 将分离自以色列棉花种子上的枝孢菌定为C.tenuissimum，后被Bensch 鉴定为C.cladosporioides[1]。国内关于棉花枝孢病害报道更少，张中义等于1996―2003 年在中国陆续发布了有关新的枝孢菌，并将我国发生于棉花叶片上的枝孢菌鉴定为（C.gossypiicola）[10]。但目前国内外均未见有棉铃枝孢菌病害的报道。

自2015 年开始，新疆棉田在结铃后发生了一种新的棉铃病害，即僵铃与裂铃病。2017 年该病在全疆大发生，重病棉田僵铃和裂铃率高达37%；2018 年该病虽发生较轻，但重病田发病率也达18.9%。为了明确该病发生的原因，为其防治提供依据，进行了本研究。

1 材料与方法

1.1 病害调查、病样采集及症状描述

2017 年和 2018 年 8―9 月间，对北疆石河子植棉区及南疆阿克苏植棉区的20 个植棉单位的棉花僵铃与裂铃病的发生情况开展调查，记录病害的典型症状，同时采集典型症状（具有橄榄绿色霉层）的病样38 份，共1 133 个病铃，选出152个供分离鉴定。并对田间症状和接种后的症状进行观察、描述和拍照。

1.2 病菌的分离、纯化及代表性菌株的选择

采用常规稀释分离法[12]，对病原进行分离及单孢纯化，然后根据采样地点、棉花品种和菌落特征选取20 个代表菌株（南疆12 个，北疆8 个，具体见表1），4 ℃保存在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextrose agar medium，PDA）斜面试管上，供鉴定及后续研究。

1.3 菌种鉴定

1.3.1形态学鉴定。形态学鉴定主要参考Bensch等于 2012 年发表的 《The genusCladosporium》[1]和 Bensch 等于2015 年发表的 《Commen but different: The expanding realm ofCladosporium》[13]。将分离纯化的20 个代表性菌株在PDA 培养基上培养14 d 后，观察菌落颜色和形态，并镜检其分生孢子形态及颜色；用常规显微计测的方法测量50 个孢子和孢子梗的大小。用玻片培养法，25 ℃下培养5 d，观察分生孢子梗和分生孢子着生状态，及分枝分生孢子、分生孢子和孢痕的形态。同时，用扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM） 对枝孢菌独特的孢痕结构、分生孢子梗和分生孢子表面纹饰进行观察并拍照。

表1 菌株样品编号及来源Table 1 Number and source of isolates

1.3.2分子生物学鉴定。将供试的20 个纯化菌株在PDA 平板培养基上培养14 d 后，用刀片刮取菌丝体，用Bio Flux 试剂盒提取供试菌株的基因组DNA。将提取的DNA 置于－20 ℃冰箱中保存，备后续试验。根据Braun 等[14]和Schubert等[7]多位点DNA 序列分析方法，分别用rDNAITS序列ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）、肌动蛋白编码基因的部分序列 ACT-512F（5'-AT-GTGCAAGGCCGGTTTCGC-3'） 和ACT-783R（5'-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3'） 以及翻译延长因子编码基因的部分序列TEF1-728F（5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'）和 TEF1-986R（5'-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3'）为引物进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增，扩增产物分别用质量分数为1%（rDNAITS）和 2%（ACT、TEF1-α）的琼脂糖凝胶电泳检测后，进行目的片段回收、载体连接和转化，筛选阳性克隆，送至上海生物工程有限公司测序。测序结果用DNAMAN8.0 进行引物片段比对并截取，后在NCBI 上进行BlastN 比对，应用BioEdit软件进行序列拼接，采用最大似然法利用Cipres网站（https://www.phylo.org/portal2/login）的 RAxML Blackbox 进行病原系统发育树的构建，以甜菜尾孢菌Cercospora beticola（ITS、TEF1-α 和 ACT 登录号分别是 AY840527、AY840494 和AY840458）作为外群，分析菌株间的亲缘关系，确定病原分类地位。

1.4 致病性测定

分别采用3 个枝孢菌的代表性菌株C2 （代表C.cladosporioides）、C13（代表C.velox）和 C7（代表C.limoniforme） 的孢子悬浮液进行接种：即用血球计数板按常规方法配制孢子含量1×106mL－1的悬浮液装入小型喷雾器内。然后在田间随机选取健康、大小均匀的棉铃，用体积分数75%酒精擦拭铃面后再用无菌水冲洗，待铃面稍干后，分有伤（针刺）和无伤喷雾接种，每种代表性菌株接种10 个棉铃，并以不接种棉铃作为对照，然后套袋保湿，并分别于接种后4 d、8 d、12 d和32 d 观察并记录其发病情况及症状。同时对发病铃进行再分离，观察再分离菌株与接种菌株的异同。

2 结果与分析

2.1 病害调查及症状描述

经2017 年和2018 年调查，该病最早在7 月上旬发生，7 月下旬至8 月上旬进入发病高峰，一般年份以棉株倒三果枝上棉铃发生较重，但在发病较早和较重的年份病害发生提前，植株中下部棉铃也会发病（如2017 年）并出现僵铃和裂铃。潮湿情况下铃面病部出现橄榄绿色或黑绿色霉层。据调查发现，2017 年发病较重，北疆石河子重病棉田发病率平均为5.2%，南疆阿拉尔重病田发病率平均为8.0%，最重棉田发病率高达37%；2018 年发病较轻，北疆石河子重病棉田发病率平均为2.1%，南疆阿拉尔重病田发病率平均为3.6%，最重棉田发病率高达18.8%；2 年南疆棉田发病明显重于北疆。可见，该病已成为新疆棉区一种常发性病害，应引起高度重视。

2.2 病原分离及代表性菌株的选择

从南北疆20 个植棉单位共采集僵铃与裂铃病样38 份，选出152 个典型病样，从中成功分离出133 个枝孢属菌株，选取其中20 个作为代表菌株，其中北疆 8 个（编号为 C1～C8）、南疆 12个（编号为：C9～C20）。其采样地点、品种和时间见表1。

2.3 菌种鉴定

2.3.1形态学鉴定。分离菌株的主要形态特征：菌落呈天鹅绒状、絮状或绒毛状，颜色多为橄榄绿色至黑褐色或灰橄榄色；菌丝有隔，光滑、稍粗糙；分生孢子梗单生，通常直立；分生孢子链状，通常有大量分枝，多单胞；分枝分生孢子具有不止一个冠状结构的孢痕；等等。根据上述形态特征，初步将其确定为枝孢属（Cladosporium）。根据培养14 d 后20 个代表性菌株分生孢子梗、 分枝分生孢子和分生孢子大小、形状、粗糙程度及表面纹饰等特征，初步将其分为3 类。

第一类包括：C1 ～C3、C5 ～C6、C8 ～C12、C15、C18 和 C20，共 13 个菌株，在 PDA 培养基上25 ℃黑暗培养14 d 菌落直径达5.15～7.50 cm，初期菌落正面橄榄绿色，有皱褶并有些隐约轮纹；背面菌落暗绿色，并有裂纹，边缘呈白色或无色。20 d 后菌落为灰橄榄色或土黄色，呈絮状、毛毡状或绒毛状。菌丝光滑、有隔；分生孢子梗单生，光滑，有隔，直立或膝状弯曲，大小（40.97～275.32）μm×（3.01～6.03）μm；分枝分生孢子亚圆柱形、圆柱形或近卵圆形，有1 个以上（多为2个或 3 个） 孢痕，大小 （4.82～33.24） μm×（2.43～5.76） μm，有隔 0～3 个； 分生孢子卵圆形、近纺锤形或近球形，大小（2.88～9.57）μm×（1.72～4.74）μm，有隔 0～1 个。分生孢子一般链状着生或单生，每链最多有8 个分生孢子。在扫描电镜下观察，孢子表面略微光滑或有不规则的网纹。其形态特征与C.cladosporioides一致（图1-A1～A6）。

第二类包括 C4、C13、C16 和 C17，共 4 个菌株，在PDA 培养基上25 ℃黑暗培养14 d 菌落直径达4.35～4.75 cm，初期为深灰绿色，中心有绒毛状灰白色气生菌丝，边缘有2～3 mm 的趋于黑色圆环，最边缘呈白色或无色，正面菌落褶皱（由中心向外发射状），背面培养基有裂缝，菌落生长较慢；20 d 后菌落暗灰色，丝绒状、 绒毛状或絮状。菌丝表面光滑或有细疣，有隔；分生孢子梗表面光滑或有细疣，有隔，直或仅稍具膝曲状，大小（66.40～338.12） μm×（3.01～4.90） μm；分枝分生孢子狭圆柱形或宽截形，有1～3 个孢痕，大小（6.56～32.09）μm×（1.83～4.74）μm，少有隔；分生孢子椭圆形、纺锤形、球状、近球形至卵球形，大小（1.92～9.95）μm×（1.72～3.90）μm，无隔。分生孢子链状着生或单生，每链最多有5 个分生孢子。在高倍扫描电镜下可见孢子表面光滑或细疣状。其形态特征与C.velox一致 （图1-B1～B6）。

第三类包括 C7、C14 和 C19，共 3 个菌株，在PDA 培养基上25 ℃黑暗培养14 d 菌落直径达4.00～4.45 cm，初期正面橄榄绿色，边缘呈白色，有不规则褶皱，背面暗绿色，培养基开裂，菌落生长慢；20 d 后菌落颜色为土黄色，多絮状。菌丝表面刺状至微疣状，有隔，通常不分枝；分生孢子梗稍光滑、不规则粗糙或微疣状，有隔，不分枝，大小为 （43.64～268.46）μm×（2.51～6.48）μm ；分枝分生孢子锥形、狭圆柱形、椭圆形至梭形，有1～3 个孢痕，大小（7.61～33.28） μm×（2.76～6.02）μm，0～3 隔（隔膜处或稍有溢缩）；分生孢子柠檬形、 椭圆形、 倒卵圆形或纺锤形，大小 （2.61～14.40）μm×（1.93～4.82）μm，无隔。分生孢子链状或单生，每链最多有8 个分生孢子。在高倍扫描电镜下观察，孢子表面疣状或不规则刺状。其形态特征与C.limoniforme一致（图1-C1～C6）。

2.3.2分子生物学鉴定。采用真菌通用引物ITS1/ITS4 对病原基因组DNA 进行扩增，第一类菌株 （C1～C3、C5～C6、C8～C12、C15、C18 和C20）的产物为 551 bp，第二类菌株（C4、C13、C16和 C17）的为 553 bp，第三类菌株（C7、C14 和C19）的为 552 bp。在 NCBI 中 BlastN 上比对结果显示：C1、C6、C10 和 C11 分别与C.cladosporioides、C.angustisporum和C.westerdijkieae（登录号分别为 MK422159、MF422160 和 MF473314）的同源性均达到 100%，C2、C3、C5、C8、C9、C12、C15、C18 和 C20 分 别 与C.anthropophilum、C.cladosporioides和C.tenuissimum（登录号分别为MF472933、AY213641 和 AJ300331）的同源性均为 100%；第二类菌株（C4、C13、C16 和 C17）与C.velox和C.domesticum（登录号为 MF473310和MF472966）的同源性分别为100%和97.12%；C7、C14 和 C19 与C.cladosporioides、C.limoniforme、C.tenellum（登录号分别为 MH329777、MF473139 和 KX674650） 的 同 源 性 均 达 到100%。

采用肌动蛋白（ACT）引物ACT-512F/ACT-783R 对代表菌株进行PCR，第一类菌株产物片段为231 bp，第二类菌株的产物为237 bp，第三类菌株产物为230 bp。在NCBI 中BlastN 上比对结果显示：第一类菌株与C.cladosporioides（登录号分别为HM148527、MH047330）的同源性分别是99.57%和100%，与C.anthropophilum（登录号是MF574175）的同源性在96.51%以上；第二类菌株与C.velox（登录号为MF474158）的同源性为99.15%，与C.michoacanense（登录号为 LT907960）的同源性是90.76%； 第三类菌株与C.limoniforme（登录号为：KS239999）的同源性在99.13%以上，与C.allicinum（登录号为MF473754）的同源性在98.70%以上。

图1 菌株形态Fig.1 Morphological characteristics of isolates

采用翻译延长因子引物TEF1-728F/TEF1-986R 对代表菌株进行 PCR，发现 C1、C6 和 C8产物片段为 243 bp，C10 的 为 244 bp，C2、C3、C5、C9、C12、C15、C18 和 C20 产物片段长度为245 bp，C11 产物片段长度是 246 bp，C4、C13、C16 和 C17 的产物片段为 268 bp，C7、C14 和C19 产物片段为 238 bp。在 NCBI 中 BlastN 比对结果表明：第一类菌株与C.cladosporioides（登录号 分 别 为 HM148258、HM148289、HM148260 和HM148266）的同源性为97.56%～100%；第二类菌株与C.velox（登录号分别为 KT600556 和KJ596597）的同源性分别为97.28%和99.59%，第三类菌株与C.limoniforme（登录号为KX240011）的同源性在94.56%以上。

对供试菌株进行多基因系统发育树结果分析，第一类菌株 C1、C6、C8、C10、C11 与 C2、C3、C5、C9、C12、C15、C18、C20 分别在 2 个分枝上，但均与C.cladosporioides聚在一起；第二类菌株（C4、C13、C16 和 C17） 与C.velox聚在一起，形成一个明显的分支； 第三类菌株 （C7、C14 和C19）与C.limoniforme聚在一起；外群甜菜尾孢菌Cercospora beticola与枝孢属真菌位于明显不同的另一分枝上（图2）。根据上述病原的形态特征及多基因联合系统发育分析，确定分离到的菌株为枝孢菌（Cladosporium），有 3 种，分别是C.cladosporioides、C.velox以及C.limoniforme，其中C.cladosporioides占供试菌株的65%，为优势种。

2.4 致病性测定

图2 基于rDNA-ITS / TEF1-α/ACT 联合序列的供试菌株与相似种的系统发育树分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the tested strains with similar species based on combined rDNA-ITS/TEF1-α/ACT sequence

图3 僵铃与裂铃田间与接种症状Fig.3 Symptoms of stiffness and cracking boll in field and inoculation

C2、C13、C7 这 3 种代表性菌株进行人工接种，在有伤接种的情况下，第4 天在棉铃上出现紫红色或褐色小点，之后小点逐渐扩大，若气候干燥则病斑扩展很慢，若气候潮湿则病斑扩展较快，严重时病斑互相融合连接成片（图3-5），最后棉铃的病斑处坏死、干枯，导致棉铃不能正常吐絮，形成僵铃或裂铃；潮湿情况下病斑处产生橄榄绿色或黑绿色霉层（图3-6），与田间症状（图3-1～3）相似。无伤接种发病较晚，病斑扩展也较慢（图3-4），对照都不发病（图3-7）。从病斑处再分离，可分离出接种菌株。

3 讨论与结论

自2015 年以来在新疆棉田发生了一种新的棉铃病害，即棉铃被感染后常形成僵铃和裂铃；潮湿情况下则在病部表面产生一种橄榄绿色或黑绿色的霉层。现该病已成为新疆棉田一种常见的病害。由于它的发病率基本等于其造成的减产率，所以必须高度重视。该病害和以往的棉花烂铃病明显不同，并不局限在棉株中下部棉铃发生，有时在上部棉铃发生也重。根据柯赫氏法则，对该病的病原进行分离鉴定，确定为枝孢菌（Cladosporium）。

由于枝孢菌有些种彼此之间在形态上具有相似性，同时其分生孢子的大小、形状、分隔、着色、表面纹饰等形态特征易受环境条件的影响，具有高度可变性，所以仅根据形态学进行枝孢菌种的鉴定存在一定的困难，必须结合分子生物学鉴定。本研究使用rDNA-ITS、肌动蛋白（ACT）和翻译延长因子1-α（TEF1-α）的编码基因序列对供试菌株进行了分析，发现rDNA-ITS 鉴别性较低，这与Lee 等[15]研究结论相一致；ACT 和TEF1-α 区分枝孢菌不同复合种（Complex）的效果大致相同，但TEF1-α区分复合种内不同菌种的效果要比ACT 精确。所以，在枝孢菌分子生物学水平上，通过分析ACT 和TEF1-α 的编码基因序列可更好地对枝孢菌的种进行鉴别。这与Bensch 等[1]的研究结论相一致。

以形态学鉴定为基础，经致病性测定，结合rDNA-ITS、肌动蛋白（ACT）和翻译延长因子 1-α（TEF1-α）的编码基因序列分析，确定引起新疆棉田僵铃与裂铃病的枝孢菌共有3 种： 即C.cladosporioides、C.velox和C.limoniforme，其中C.cladosporioides是其优势种。由枝孢菌所引起的铃病在我国属首次发现。

致谢：

感谢石春发先生（贵州黔东南州林业科学研究所）在系统发育树制作上的技术指导。