周闰 周玲红 申超峰 邓朝艳 黄丽芳

摘要：选用兔眼蓝莓“灿烂”当年生半禾质化带腋芽茎段做外植体。从3月下旬至6月下旬共7次取材，根据外植体木质化程度的不同，选取不同的消毒试剂和消毒时间，为筛选出不同取材时间最适合的灭菌方法进行了实验，结果表明：“灿烂”最佳的取样时期是4月份，最佳灭茵方法是将茎段分为嫩部及半木质化部两部分，嫩部用0.1%升汞灭菌6～7min最佳，其污染率为4.4%～6.7%，褐化率为6.7%～11.1%·萌芽率达到84.5%～86.7%;半木质化部用0.1%升汞灭茼10～11rain最佳，其污染率为4.4%～13.3%，褐化率为2.2%～6.7%，萌芽率达到84.5%～88.9%。

关键词：蓝莓;组织培养;取材时间;灭茵方法

中图分类号：Q945.78 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）19-0169-03

1引言

蓝莓（Blueberry），又名越橘或浆果，杜鹃花科，越桔属，多年生灌木小浆果果树。蓝莓果实风味独特，营养丰富，被誉为“世界第三代水果之王”。蓝莓低糖、低脂肪、抗氧化能力强，还具有增强人体免疫力、抗癌、延缓衰老，防止脑神经老化、强心、软化血管等功能，因此被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一。由于果实具有独特的风味及营养保健价值，蓝莓作为一种高档水果深受市场欢迎，栽培蓝莓的经济效益显著。

中国蓝莓产业发展相对较晚，大部分品种均引自国外，优良品种相对较少，为促进蓝莓产业的发展，需在短期之内获得大量的优质种苗，而蓝莓的常规繁殖方法速度较慢、繁殖规模受到阻碍且苗木在生长势、果实品质等诸多方面存在不足，故进行工业化批量生产，则需利用组培快繁技术。

在组织培养中，外植体的灭菌效果直接关系到后续芽诱导的效果及组培苗的成活率，确定合适的灭菌方法在生产实践中尤为重要。实验旨在比较研究不同取材时间采取不同灭菌方法对蓝莓外植体灭菌效果的影响，最大限度降低外植体的污染率，为蓝莓规模化组培快繁生产实践提供理论参考。

2材料与方法

2.1供试材料

组培所用的蓝莓外植体为兔眼蓝莓品种“灿烂”，于2019年3～6月份共7次采自于郴州市农科所保和果蔬基地五年生的蓝莓植株，取样时间分别为3月26日、4月9日、4月25日、5月7日、5月23日、6月5日、6月23日。

2.2方法

2.2.1材料处理

在连续天气晴朗3d后的上午11：00剪取枝条，选取生长旺盛、无病虫害的当年生的健壮嫩梢，将叶片去掉，留少量叶柄，在水龙头下用流水冲洗干净，然后将枝条分为半木质化部及嫩部两部分，其中半木质化部的枝条剪成长约1～2cm的带腋芽茎段，嫩部则剪成长3～4cm带腋芽茎段。剪取的蓝莓茎段，直接加无菌水放置于恒温震荡器上震荡0.5～1h，期间更换无菌水2次，滤干水后置于超净工作台上进行外植体灭菌。

2.2.2外植体表面消毒

半木质化部的茎段先用75%酒精浸泡30S，倒出酒精，用无菌水清洗一遍，再用含0.1%吐温80的0.1%升汞溶液浸泡10～15min;嫩部茎段直接用含0.1%吐温80的0.1%升汞溶液浸泡5～9min。消毒時不断摇动，消毒后的茎段用无菌水清洗5次，滤干水分，再用无菌滤纸吸干水分备用。切去两端受损组织，嫩部茎段还需再剪成1～2cm长的带腋芽的茎段，按无菌操作要求接种于初代培养基上，每瓶接种1个茎段。然后放置于培养室，观察不同灭菌处理的效果。

2.2.3培养条件

试验以1/2MS为基本培养基，添加玉米素（ZT）和NAA作为外源激素：ZT浓度为1.0mg/L，NAA浓度为0.01mg/L，培养基中蔗糖含量为3%，琼脂含量为0.65%，pH值调至5.8，将配制好的培养基置于121℃，1.1kg/cm²压力下高温灭菌20min。接种好的材料在23～28℃，12h/d光照，2000lx光照强度下进行培养。

2.2.4数据处理

接种后定期记录材料情况，接种20d后统计污染率、褐化率、萌芽率。

污染率=（外植体中染菌的数量/接种的外植体总数）×100%，

褐化率=（外植体中褐化的数量/接种的外植体总数）×100%，

萌芽率=（萌芽不污染的外植体数量/接种的外植体总数）×100%。

3结果与分析

3.1不同取材时间最佳的灭菌方法

从表1可知，3月份取材的外植体嫩部用0.1%升汞灭菌4～6min，其污染率低于4.4%，但是褐化率达57.8%以上，导致其萌芽率在17.8%以下;3月份取材的半木质化部灭菌4～8min处理，其污染率低于8.9%，但是褐化率达35.6%以上，其萌芽率在44.4%以下。从表2可知，4月份取材的外植体嫩部用0.1%升汞灭菌6～7min最佳，其污染率为4.4%～6.7%，褐化率为6.7%～11.1%，萌芽率达到84.5%～86.7%;4月份取材的半木质化部灭菌10～11min最佳，其污染率为4.4%～13.3%，褐化率为2.2%～6.7%，萌芽率达到84.5%～88.9%。从表3可知，5月份取材的外植体嫩部用0.1%升汞灭菌8～9min最佳，其污染率为13.3%，褐化率为4.4%～8.9%，萌芽率达到73.3%～82.2%;5月份取材的半木质化部灭菌12～14rain最佳，其污染率为11.1%～15.6%，褐化率为2.2%～6.7%，萌芽率达到75.6%～82.2%。从表4可知，6月份取材的外植体嫩部用0.1%升汞灭菌10～12min最佳，其污染率为17.8%～24.4%，褐化率为8.9%～13.3%，萌芽率达到42.2%～57.8%;6月份取材的半木质化部灭菌15～16min最佳，其污染率为17.8%～35.6%，褐化率为8.9%～13.3%，萌芽率达到37.8%～57.8%。

3.2不同取材时间对萌芽率的影响

不同取材时间对灿烂茎段外植体的萌芽率影响很大，由表1～4可知，在3月下旬取的茎段，其萌芽率最高才达到44.4%，说明3月份取材不合适;在4～5月份取的茎段，萌芽率为75.6%～88.9%，芽诱导率高，是合适的取材时间;6月上旬取的茎段，萌芽率为55.8%，6月下旬取的茎段，萌芽率降到42.2%以下，说明6月下旬不适合取材。

4结论与讨论

4.1结论

兔眼蓝莓“灿烂”茎段外植体的取材时间不同，其最适合的灭菌方法也有变化：3月下旬至6月下旬，随着季节的推迟，需要逐渐增加0.1%升汞灭菌的时间，才能将污染控制在较低的水平内。

不同取材时间对“灿烂”茎段外植体的腋芽诱导率影响很大，3月下旬取材，腋芽诱导率44.4%以下，4月至6月上旬腋芽诱导率在57.8%以上，6月下旬腋芽诱导率在42.2%以下，因此，“灿烂”最佳的取样时期是春稍生长期枝条刚开始木质化的4月份，污染率低，诱导效果最好，5月至6月上旬取样，污染率有所提高，但是萌芽率较高，也能成功建立茎段无菌培养体系，而6月下旬取样，茎段培养污染率高，腋芽诱导率低，不适合取材。这与涂俊凡等的研究一致。

4.2讨论

菌类污染是植物组织培养中较为常见的问题，使用的消毒剂既要能够把外植体表面的杂菌杀死，又必须容易被无菌水从外植体上冲洗干净而不至于对外植体本身产生较大的毒害作用进而影响其正常生长。75%酒精渗透力很强，在短时间内便可进入植物细胞行使其毒力作用，所以应用酒精消毒一般是在15～30s之内，即便这样，也可能会造成外植体一定的死亡率。所以在本试验中，对外植体嫩部并没有用酒精进行消毒，在培养过程中的褐化率相对较低。0.1%升汞是组织培养中常用的强消毒剂，具有很强的穿透力和杀伤力，容易杀死和损伤细胞，造成外植体的死亡。因此在使用时，应当控制好消毒的具体时间，既要能杀死表面的杂菌，又不能对外植体造成太大伤害。所以，筛选准确的消毒时间对后续工作有至关重要的作用。

外植体取材时间对能否成功建立蓝莓离体培养体系具有重要影响。在蓝莓离体培养芽诱导初期，不同取材时间对诱导芽萌发的效果不同，这种差异可能来自于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶活性的季節性变化。芽萌发初期，叶片及新梢中酚类物质较少，随着新梢的生长，酚类物质积累，多酚氧化酶活性增强，取样外植体易褐化，影响初代培养效果。因此，合适的外植体取材时期是蓝莓组培快繁成功与否的关键因素之一。