姜梅杰,张志军,刘丽娟,李 琳

(1.山东省泰安市中心医院检验科 271000；2.山东省济南市人民医院检验科 271100;3.山东省泰安市中心医院感染管理科 271000)

多重耐药肺炎克雷伯菌已是院内感染重要病原菌之一。中国CHINET细菌耐药性监测发现，近年来肺炎克雷伯菌分离率一直位居第二位，对阿米卡星耐药率为9.0%～12.6%[1-6]。β-内酰胺类等是临床治疗肺炎克雷伯菌引起感染的常用抗菌药物。但近年来,由于临床分离的肺炎克雷伯菌对头孢菌素类、碳青霉烯类抗菌药物的耐药率迅速增加，已给临床治疗肺炎克雷伯菌引起的感染带来了巨大的困难。为寻找肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的原因，防止院内多重耐药肺炎克雷伯菌的暴发流行。本研究对阿米卡星耐药的肺炎克雷伯菌进行同源性及β-内酰胺类相关耐药基因研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1菌株来源 27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌来源于2013年6月至2014年11月泰安市中心医院(医院1)和山东省立医院(医院2)临床分离的标本中,其中医院1为22株(菌株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23)、医院2为5株(菌株14、24、25、26、27)。14株标本来自患者的痰液，10株标本来自患者的尿液，3株标本来自患者的穿刺液。

1.2方法

1.2.1细菌鉴定及药敏试验 细菌鉴定及药敏试验采用WalkAway 96 PLUS微生物全自动分析仪。部分抗菌药物的敏感性采用纸片扩散法和E-test法。

1.2.2同源性分析 参照美国CDC(PulseNet USA，2002)制订的对大肠杆菌节进行脉冲场凝胶电泳的统一方法设计实验。同源性分析采用脉冲场电泳(PFGE)法,将PFGE图像录入BioNumerics(Version 5.1,Appliedmaths,Inc.)软件包进行处理,识别图像条带,经统一的分子质量标准进行校准(沙门菌H9812),标定条带位置,必要时进行手工校正本分析，以80%同源性作为临界值来分型。

1.2.3耐药基因检测 β-内酰胺酶基因引物参照文献[7-9]，均为PCR法。NDM-1基因PCR扩增引物序列参照中国疾病预防控制中心传染病预防控制所公布的引物序列。

1.2.4DNA测序 对部分阳性基因进行测序，PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序结果在GenBank网上查询。

1.3统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行分析，菌株信息和药敏结果录入WHONET5．6软件。

2 结 果

2.1抗菌药物敏感试验情况 27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南、厄他培南、哌拉西林/他唑巴坦、复方新诺明、头孢吡肟、头孢西丁、氧氟沙星、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸的耐药率分别为25.93%、25.93%、25.93%、51.85%、77.78%、85.19%、85.19%、85.19%、85.19%、92.59%。

2.2肺炎克雷伯菌PFGE检测情况 PFGE显示 27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌分为14种谱型，见图1。主要为E谱型(22.22%)，其次为D谱型(11.11%)、H谱型(11.11%)和M谱型(11.11%)，其余谱型1～2株。菌株14、18、20、21、22、25同源性100% 为E谱型,E谱型在2家医院存在克隆流行株。

图1 27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌PFGE 分型情况

图2 CTX-M3群基因PCR产物部分电泳图

2.3β-内酰胺类耐测基因检测及测序情况 27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌中，100%(27/27)的β-内酰胺酶基因阳性。9株CTX-M3群基因阳性，检出率为33.33%，见图2；14株CTX-M1群基因阳性，检出率为51.85%；6株KPC基因阳性，检出率为22.22%；1株NDM-1基因阳性，检出率为3.70%，见图3；14株DHA基因阳性，检出率为51.85%；23株SHV基因阳性，检出率为85.19%；27株TEM基因都阳性，检出率为100.00%。分别对不同谱型的CTX-M3群阳性基因、CTX-M1群阳性基因、KPC阳性基因、SHV阳性基因、DHA阳性基因、TEM阳性基因进行测序，经分析6株(22.22%)为CTX-M-15型超广谱β-内酰胺酶基因、3株(11.11%)为CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶基因、4株(14.81%)为CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶基因、10株(37.03%)为CTX-M-65型超广谱β-内酰胺酶基因、6株(22.22%)为KPC-2型碳青霉烯酶基因、11株(40.74%)为SHV-12型超广谱β-内酰胺酶基因(图4)、3株(11.11%)为SHV-1型广谱β-内酰胺酶基因、9株(33.33%)为SHV-11型非超广谱β-内酰胺酶基因、14株(51.85%)为DHA-1型头孢菌素酶基因、27株为TEM基因TEM-1型广谱β-内酰胺酶基因、1株为NDM-1金属β-内酰胺酶基因。β-内酰胺类阳性耐药基因的分布情况及β-内酰胺类抗菌药物敏感性试验检测结果见表1。

图3 NDM-1基因PCR产物部分电泳图

图4 SHV-12基因测序图

表1 27株β-内酰胺类阳性基因的分布情况及β-内酰胺类抗菌药物敏感性试验检测情况

续表1 27株β-内酰胺类阳性基因的分布情况及β-内酰胺类抗菌药物敏感性试验检测情况

+：β-内酰胺酶基因阳性；-：β-内酰胺酶基因阴性；S：敏感；R：耐药

3 讨 论

肺炎克雷伯菌已是院内感染重要病原菌之一。细菌耐药监测结果显示,2013-2016年泰安市中心医院肺炎克雷伯菌对阿米卡星耐药率为4.5%～7.3%，但耐药性严重。吕爽等[10]报道的吉林大学中日联谊医院2013-2015年每年临床分离的肺炎克雷伯菌对阿米卡星耐药率均小于5.5%，低于泰安市中心医院2013-2015年每年临床分离的肺炎克雷伯菌对阿米卡星耐药率。说明不同医院同一时间段临床分离的肺炎克雷伯菌对阿米卡星的耐药率不完全相同。

本研究的27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌中，有22株来源于医院1，其余5株来源于医院2。研究发现菌株14、18、20、21、22、25同源性100%为E谱型，其中菌株14、25来源于医院2，菌株18、20、21、22来源于医院1，说明2家医院存在相同的E谱型克隆株。医院1的重症患者经常转入医院2进行治疗，本研究中的医院2患者与医院1患者感染的耐阿米卡星肺炎克雷伯菌存在同源性100%菌株，究其原因将继续研究。警示医院感染控制管理部门不仅应关注院内，同时也应关注医院间耐药菌的传播流行。

历年CHINET细菌耐药性监测数据显示，肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别从2005年的3.0%、2.9%上升到了2017年的20.9%、24.0%，与此同时，肺炎克雷伯菌每年的分离率亦呈稳步上升趋势[1-6]。产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制，包括A、B、D 3类[11]。KPC-2为A类碳青霉烯酶，NDM-1为金属β-内酰胺酶。2001年YIGIT等[12]在美国报道了产KPC-1型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌；随后其他地区相续发现了产KPC型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌[13-17]。有研究表明，产碳青霉烯酶类药物水解酶KPC-2是导致华东地区克雷伯菌属对碳青霉烯类耐药的重要原因之一[18]。携带有blakpc-2的细菌对包括碳青霉烯类在内的所有β-内酰胺类抗菌药物耐药[19]。本研究27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌中，有6株产KPC-2型碳青霉烯酶、1株产NDM-1金属酶,这7株菌对亚胺培南、美罗培南和厄他培南等β-内酰胺类抗菌药物均耐药,其余20株对亚胺培南、美罗培南和厄他培南均敏感的耐阿米卡星肺炎克雷伯菌未检测出碳青霉烯酶，说明KPC-2型碳青霉烯酶和NDM-1金属酶是引起亚胺培南、美罗培南和厄他培南耐药的重要因素之一。研究显示，产NDM-1酶菌株在易于通过质粒不同细菌之间进行水平传播，应引起重视并加强监控，以避免其在临床菌株中的快速扩散[20]。

有4株产DHA-1头孢菌素酶基因，未检出超广谱β-内酰胺酶基因和碳青霉烯酶基因的耐阿米卡星肺炎克雷伯菌对四代头孢菌素(头孢吡肟)和碳青霉烯酶类抗菌药物(亚胺培南、美罗培南、厄他培南)敏感，对一代头孢菌素(头孢唑啉)、二代头孢菌素(头孢夫新)和三代头孢菌素(头孢噻肟、头孢他定)耐药,说明产DHA-1头孢菌素酶的肺炎克雷伯菌对一代、二代、三代头孢菌素均耐药,对四代头孢菌素和碳青霉烯酶类抗菌药物敏感。ESBLs是由质粒介导产生的水解酶类，能水解超广谱头孢菌素类、青霉素类及氨曲南等[21]。本研究20株检出CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因中，有3株同时携带2种CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因、10株同时携带SHV-12型超广谱β-内酰胺酶基因、6株同时携带KPC-2型碳青霉烯酶基因，说明了耐阿米卡星肺炎克雷伯菌对头孢菌素类抗菌药物耐药是多种β-内酰胺类耐药基因参与造成的。

综上所述，耐阿米卡星肺炎克雷伯菌耐药严重，在2家医院发现相同的克隆株,医院感染控制部门应密切监控医院内和医院间耐药菌的传播。具体播散机制和临床治疗方案有待进一步研究。