肖锦新 闫赟 杜丽波 余秀兰 陈德胜 潘玉杰

[摘要]目的 探讨替芬泰（TFT）对2.2.15细胞分泌乙肝表面抗原（HBsAg）的影响。方法 以乙肝病毒的脱氧核糖核酸（HBV-DNA）克隆转染人肝癌细胞HepG2 2.2.15细胞系作为实验模型，TFT配制成102、51、25.5 μm的药液，另设拉米夫定（LAM）218 μm阳性对照组（简称为LAM 218 μm组）和病毒对照组，分别加入24孔细胞培养板中，0.6 ml/孔，每浓度4孔。每4天换液1次，第8天收集细胞上清液。采用酶联免疫法（ELISA）检測细胞上清液中HBsAg的滴度，比较各组3个批次的OD值，并记录其平均抑制率。结果 LAM 218 μm组的OD值明显低于病毒对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;TFT 102、51、25.5 μm组的OD值均明显低于病毒对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。LAM 218 μm、TFT 102、51、25.5 μm组的平均抑制率分别为37.49%、56.26%、47.33%、36.82%。结论 TFT能有效抑制HBsAg分泌，从而发挥出抗HBV的作用，可为进一步研发TFT成为抗HBV新药提供数据支持及参考。

[关键词]替芬泰;2.2.15细胞;乙肝表面抗原

[中图分类号] R322.47          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）9（c）-0041-03

[Abstract] Objective To explore the effect of Tifentai （TFT） on secretion of Hepatitis B surface antigen （HbsAg） in 2.2.15 cells. Methods Hepatitis B virus deoxyribonucleic acid （HBV-DNA） clones were used to transfect human hepatoma cells HepG2 2.2.15 cell line as experimental model， and TFT was prepared into 102， 51， 25.5 μm solution. Lamivdine （LAM） 218 μm positive control group （referred to as LAM 218 μm group） and virus control group were established， and they were added to 24-well cell culture plates， 0.6 ml/well， 4 wells per concentration. The solution was changed once every 4 days， and the cell supernatant was collected on the eighth day. The titer of HBsAg in the cell supernatant was determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， and the OD values of the three batches in each group were compared， and the average inhibition rate was recorded. Results The OD value of the LAM 218 μm group was significantly lower than that of the virus control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The OD values of the TFT 102， 51， and 25.5 μm group were significantly lower than those of the virus control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The average inhibition rates of the LAM 218 μm， TFT 102， 51， and 25.5 μm group were 37.49%， 56.26%， 47.33%， and 36.82%， respectively. Conclusion TFT can effectively inhibit the secretion of HBsAg， thereby exerting its anti HBV effect， and can provide data support and reference for further research and development of TFT to become a new anti-HBV drug.

[Key words] Tifentai; 2.2.15 cells; Hepatitis B surface antigen

乙肝是一种病死率较高的传染性疾病，由乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起，严重威胁人类健康[1]。目前临床上常用核苷类药物和干扰素治疗乙肝，但这些药物均存在效果不佳或者较为昂贵等不足[2]。替芬泰（Tifentai，TFT）是一种二肽衍生物，从苗药马蹄金中分离出，其独特的抗病毒机制主要是通过诱导机体的免疫反应发挥作用[3-4]。TFT已被证实具有良好的抗HBV的作用，且具有较轻的毒副作用、耐药性良好等优点[5-7]。目前，TFT对HBV影响的相关报道较少，因此，本研究以HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞HepG2 2.2.15细胞系作为实验模型，观察TFT对2.2.15细胞分泌乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）水平的影响，现报道如下。

1材料与方法

1.1药物、试剂与主要仪器

1.1.1药物  TFT，纯度为99%，贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室合成，批号：20140106;拉米夫定（Lamivdine，LAM），100 mg/片，葛兰素史克制药有限公司生产，批号：13030039。

1.1.2 HepG2 2.2.15细胞  乙肝病毒的脱氧核糖核酸（Hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV-DNA）克隆转染人肝癌细胞HepG2 2.2.15细胞系，由美国Mount Sinai医学中心构建，本临床药理研究室自行传代培养。

1.1.3试剂  DMEM培养液（美国Coring公司，批号：10013630R）;胎牛血清（美国Gibco公司，批号：1527494）;胰蛋白酶（Amresco公司）;EDTA（Amresco公司）;G418（美国Corning公司，批号：30002226）;DMSO（Vetec公司）;0.22 μm无菌滤器（sartorius stedim公司）;HBV表面抗原诊断试剂盒（北京科卫临床诊断试剂有限公司，批号：201407002）。

1.1.4主要仪器  二氧化碳（CO2）培养箱（美国Thermo公司）;倒置显微镜（日本Olympus公司）;细胞培养瓶（美国Coring公司）;24孔细胞培养板（美国Coring公司）;低温高速离心机（美国Thermo公司）;电子分析天平（上海天平仪器厂）;生物安全柜（美国Thermo公司）;超低温冰箱（海尔集团）;BioTek全自动全波长自动酶标仪及Bio TeK Instruments全自动酶标洗板机（北京海淀区天石医疗用品制作所）。

1.2方法

1.2.1细胞培养  选用对数生长期的2.2.15细胞，用0.02%的EDTA洗两遍，加入0.25%胰蛋白酶1 ml，静置消化3～5 min，轻轻吹散细胞成单个状态，进行1：1传代，每瓶加入200 μg的G418，放入5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。细胞传代3～4次后可用作实验。

1.2.2细胞接板  选用对数生长期的2.2.15细胞，用0.02% EDTA进行清洗，清晰2次，再加入0.25%胰蛋白酶1 ml消化3～5 min，吹打均匀后，计数到2×105个细胞/ml，然后将其接种至24孔细胞培养板中，0.5 ml/孔。放入5% CO2、37℃细胞培养箱培养进行培养，培养至细胞贴壁后方可进行实验。

1.2.3分组及给药  TFT配制成浓度从高到低依次为102、51、25.5 μm的药液，同时另设LAM 218 μm阳性对照组（简称为LAM 218 μm组）和病毒对照组，分别加入24孔细胞培养板中，0.6 ml/孔，每浓度4孔。每4天换液1次，第8天收集细胞上清液，酶联免疫法（ELISA）检测细胞上清液中HBsAg的滴度。实验分3个批次。

1.3观察指标

通过检测细胞上清液中HBsAg的滴度，计算药物抑制HBsAg的抗原百分率（%）、3个批次的平均抑制率，比较各组不同批次的OD值以观察TFT 102、51、25.5 μm及LAM 218 μm对2.2.15细胞分泌HBsAg水平的影响，并记录其平均抑制率，计算公式如下：抗原抑制率（%）= ×100%。

1.4統计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

LAM 218 μm组的OD值明显低于病毒对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;TFT 102、51、25.5 μm组的OD值均明显低于病毒对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;LAM 218 μm、TFT 102、51、25.5 μm组的OD值比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。LAM 218 μm、TFT 102、51、25.5 μm组的平均抑制率分别为37.49%、56.26%、47.33%、36.82%（图1）。

3讨论

40多年前，HBsAg已被发现是一种HBV的外壳蛋白，自身不具有传染性，但它的出现往往会伴随HBV的存在，在患者的阴道分泌物、精液、鼻咽分泌物、泪水、汗液、乳汁、唾液、血液均可检测到HBsAg，目前已经被临床用作于HBV感染的标志[8-9]。血液中的HBsAg浓度水平更能准确反映机体内的真实水平，且样本获取方式简单，准确度高。临床上往往通过检测患者血清中HBsAg的表达水平来鉴定是否感染HBV，HBsAg至今仍是HBV感染的最为明显标志[10]。有研究[11]显示，血清的HBsAg滴度水平还与HBV传染性呈正变关系，但并非肯定的一致关系，可见，血清HBsAg的滴度水平可作为传染性的参考指标之一，滴度水平越高，说明机体内的e抗原（Hepatitis Be antigens，HBeAg）、脱氧核糖核酸聚合酶（deoxyribonucleic acid polymerase，DNAP）、HBV-DNA阳性的概率越大，传染性也越强。血清中的HBsAg滴度水平与乙型肝炎的严重程度之间没有必然关系，主要是由于肝炎的严重程度更多与机体的肝功能有关，肝功能是体内肝细胞损伤程度的影响，同时也与个体的免疫系统的强弱有关，相同HBsAg滴度水平的携带者，可表现为慢性活动性肝炎、也可表现为肝脏纤维化，肝硬化晚期、或者肝癌等。甚至部分肝功能正常且无临床症状体征的患者，体内的HBsAg滴度水平很高，而一些重症肝炎且肝功能严重损害的患者，其体内的HBsAg滴度水平却很低，甚至表现为阴性。但也有研究得出的结果表明，HBsAg滴度与肝炎的严重程度相关[12-13]。

本研究结果显示，TFT 102、51、25.5 μm组的OD值均明显低于病毒对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;TFT 102、51、25.5 μm组的平均抑制率分别为56.26%、47.33%、36.82%，呈现出良好的浓度依赖性，提示随着TFT药物浓度水平的升高，2.2.15细胞分泌HBsAg的水平越低，高浓度的TFT对2.2.15细胞分泌HBsAg抑制效果越强，且在给药8 d时抑制效果最强，TFT具有较强的抗HBV活性，可能与TFT的药物成份有关。TFT是一种从苗药马蹄金中分离而成的二肽衍生物[14]，具有与其他核苷类药物不同的抗病毒机制，一方面是通过调控HBV复制下游Calcium-PyK2信号通路及p21因子，从而发挥HBx蛋白的功能的影响，进而达到抑制HBV复制目的;另一方面并可通过影响机体内B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、白细胞介素-21（IL-21）等相关免疫因子，从而发挥抗HBV作用[15]。本研究仅为细胞实验，详细作用机制仍需更多研究来进一步證实。

综上所述，替芬泰能有效抑制HBsAg分泌，从而发挥出抗HBV的作用。为进一步研发替芬泰成为抗HBV 新药提供数据支持及参考。

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（收稿日期：2019-04-04  本文编辑：任秀兰）