杨艳 高渐飞 王丽 张凡 周玮

摘要：为探索马比木根茎中总黄酮和总三萜含量及其胰岛素抵抗降糖活性，对其采用甲醇提取测定根、茎总黄酮和总三萜含量，用HepG2细胞制备胰岛素抵抗降糖模型，进行了降糖活性的检测。结果显示：根中总黄酮含量（204.75mg/g）高于茎中含量（114mg/g）;总三萜的含量根中（145mg/g）低于茎中含量（225.17mg/g）。采用MTT法对HepG2细胞进行活力检测，排除提取物溶剂及提取物的细胞毒性，且细胞活性良好，具有消耗葡萄糖的能力。与阳性药二甲双胍进行降糖活性对照，根一茎提取物的不同剂量的降糖活性均优于阳性药。根提取物的降糖活性优于茎提取物，这与总黄酮的含量结果一致，说明降糖活性与总黄酮具有正相关的作用。实验结果说明了总黄酮的降糖活性优于总三萜的降糖活性。这为马比木资源的再利用提供新的思路和途径，既开拓了马比木功效利用的短板，又减少了马比木资源的过度消耗和浪费。

关键词：马比木;总黄酮;总三萜;MTT;降糖活性

中图分类号：R975 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）18-0167-04

1引言

马比木（Notha podytes P2ittosporoides oliv.sleum）为茶茱萸科植物海桐假柴龙树，分布于贵州、湖北、四川、湖南等地。马比木植株因其根部含有喜树碱及喜树碱的甲氧基衍生物，具有较好的抗肿瘤活性，已经成为了抗肿瘤药物的主要原材料之一。随着市场对喜树碱及其衍生物需求量的增长和国家对喜树植株的重点保护，马比木作为喜树碱新药源的主要原料来源，越来越受到关注。如早有大量文献报道了马比木中喜树碱含量测定及其提取工艺等，但其他方面尤其活性研究起步相对稍晚，鲜有报道。

马比木根（药商只收购根及主干地面向上不超过30cm）被用于提取喜树碱，其他部位因含量低而被遗弃，资源利用率较低。为探索拓宽资源利用口径及提搞马比木资源利用率的方式，对马比木根、茎提取物中总黄酮和总三萜的含量进行了测定，同时根据总三萜和总黄酮具有抗氧化，抗心血管疾病、雌激素样与抗雌激素样的作用、降血脂、降血糖、抗疲劳、调节免疫力等作用，选择其中的降血糖作用进一步探讨，旨为其资源综合科学利用提供参考。

2材料与方法

2.1材料

根、茎采于贵州黔东南州麻江县，经鉴定为茶茱萸科海桐假柴龙树属植物马比木;其中根为地下颜色呈金黄色起以下部位，茎为出土主干处往上约50cm。HepG2细胞购自北京协和医学院细胞库，人胰岛素（批号：19278MSDS）购自美国Sigma公司，DMEM培养基（货号：11965092）购自Life TeehnoIogies Corpo-ration，胰酶（货号：05171009）购自CAISSON LABORATORIES.INC，胎牛血清（批号：20170223）浙江天柱生物科技股份有限公司，四甲基偶氮噻唑盐（MTT，M2128MSDS）购自美国Sigma公司，葡萄糖测定试剂盒一氧化酶法（批号：20171004147）购自上海荣盛生物有限公司，二甲双胍（货号：D150959MSDS）购自美国Sigma公司，地塞米松（货号：D4902MSDS）购自美国Sigma公司，芦丁（批号：C27H30016）购自中国药品生物制品检定所，齐墩果酸（批号：C30H4803）购自中国药品生物制品检定所。

2.2仪器与设备

电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、超声仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）、UV-1800紫外可见分光光度计（岛津仪器（苏州）有限公司）、TDL-40C低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、生物安全洁净柜（BHC-1300A/B3）苏州净化设备有限公司、CO2培养箱（CCL-170A-8ESC0）杭州诺丁科学器材有限公司、酶标仪（BG-XM496）常州三丰仪器科技有限公司。

2.3方法

2.3.1马比木根与茎提取液的制备

将马比木根、茎粉碎过筛，分别精密称取2g马比木根、茎粉末，分别置于150mL，具塞三角瓶中，以70%甲醇为溶剂按1;60的料液比，密塞，静置15h，超声处理30min，加热回流1.5h，待溶液冷却至室温后，过滤，将滤液减压浓缩用70%甲醇定容至50mL，备用。

2.3.2对照品溶液的制备

精密称取总黄酮对照品芦丁4.2mg于5mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成浓度为0.84mg/mL的对照品储备液;精密称取总三萜对照品齐墩果酸5.0mg于5mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成浓度为1.0mg/mL的对照品储備液。

2.3.3检测波长的选择

（1）总黄酮波长的选择。取对照品溶液和供试品溶液各1.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠0.4mL，放置6min后，加入10%硝酸铝0.4mL，放置6min后，再加入4%氢氧化钠4mL，加蒸馏水至刻度线，摇匀，放置15min后，进行全波长扫描，在510nm处有最大吸收波长，故选用510nm作为检测波长。

（2）总三萜波长选择。取对照品溶液和供试品溶液各1.0mL，于100℃水浴挥干，各加5%香草醛一冰醋酸溶液0.4mL，高氯酸1.8mL，摇匀，置70℃水浴中放置15min，取出，4℃冷却5min，加冰醋酸5mL，摇匀，使之反应，10min后置比色皿中，以冰醋酸为空白溶液，在190～700nm扫描，结果在584nm处对照品与供试品的吸收均较大，故选用584nm作为检测波长。

2.3.4提取液中总黄酮和总三萜的含量测定

（1）总黄酮的含量测定。准确吸取黄酮标准品芦丁溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL容量瓶中，按2.3.3节的测定方法，在波长510nm下制订标准曲线。准确吸取马比_木根与茎的提取液1.0mL，置于10mL容量瓶，按上述的测定方法测定吸光度值，以标准曲线计算马比木根与茎中总黄酮的含量。

（2）总三萜的含量测定。准确吸取三萜标准品齐墩果酸溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL容量瓶中，按照2.3.3节的测定方法，在波长584nm下得出齐墩果酸浓度与吸光度的标准曲线。准确吸取马比木根与茎的提取液1_0mL，置于10mL容量瓶，按照2.

3.3节的测定方法测定吸光度值，以标准曲线计算马比木根与茎中总三萜的含量。

2.3.5MTT法测试细胞活力

按照细胞培养方法培养HepG2细胞，将处于对数生长期的细胞消化后，用高糖DMEM培养基调整细胞密度为1×10⁵个·mL^-1，转入96孔板中。37℃5%CO2恒温培养箱中培养24h后，弃去旧培养基加入新配制的高糖DMEM培养基，将细胞随机分为空白组、模型组、溶剂组、样品组在37℃5%CO2恒温培养箱中培养24h。在不同组别中每孔加入5mg·mL^-MTT溶液20gL，继续孵育4h，弃去上清，吸干残留液，每孔加入DMSO 150uL，37℃5%CO2恒温培养10min至生成的蓝紫色甲瓒结晶完全溶解，置于酶标仪570nm处测其吸光度值，检测HepG2细胞的活力。

2.3.6降糖活性研究

按照2.3.5节方法制备96孔板，将细胞随机分为空白组、胰岛素组、模型组、样品组和二甲双胍组。在胰岛素组加入10uL的生理盐水，在模型组、样品组和二甲双胍组加入10uL的地塞米松（浓度10～10tool/L）37℃5%CO2恒温培养箱中培养24h;弃去培养基70uL换以60uL新鲜培养基，除空白组和胰岛素组（加入70uL培养基）外其他组均加入10uL胰岛素（浓度10-8），样品组再加10uL样品，37℃5%CO2恒温培养箱中培养24h;将上述细胞液转移10uL至新的96孔板中，加入葡萄糖氧化酶混合液培养15min，于酶标仪505nm处测葡萄糖的吸光度（A），根据葡萄糖消耗量衡量其降糖活性。以不含细胞的空白孔为空白对照。

3结果与分析

3.1标准曲线分析

芦丁和齐墩果酸标准品溶液分别移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL计算出浓度，制备以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标的标准曲线（图1～图2），芦丁标准曲线回归方程为：y=1.4614X+0.0499，R=0.9841;齐墩果酸标准曲线回归方程为：y=1.3351X+0.0018，R=0.9935。由图可知两种标准物5个不同浓度的點均匀分散在线性回归方程附近，线性关系良好，可用于马比木提取液中总黄酮和总三萜的含量测定。

3.3总黄酮和总三萜的含量

马比木根与茎提取液定容至50mL，移取1mL进行总三萜和总黄酮的含量测定，做3份平行，确保检测结果准确性。测试结果显示马比木根茎提取物中总黄酮和总三萜含量较高，但根和茎中两类物质的含量有所差异，根中总黄酮含量（204.75mg/g）高于茎（114mg/g）;而总三萜的含量根中（145mg/g）低于茎中含量（225.17mg/g）表1。

3.3细胞活跃度的影响

采用MTT法对不同组别HepG2细胞活力的考察，其吸光度值与细胞活力成正比。在空白组，溶剂组，样品组和模型组分别加入MTT试剂，温度37℃5%CO：恒温培养4h，加入DMSO 150gL以后会出现蓝色的沉淀，说明该细胞是有活力的，若加入DMSO以后无颜色变化，则说明细胞没有活力，将不会消耗糖，从而数据没有参考价值。如图3所示：与空白组相比，模型组对细胞没有明显的抑制，细胞活力良好。对于样品组（根和茎提取液）来说，样品加入96空板中的浓度为1mg/mL，0.2mg/mL，0.04mg/mL，高剂量的样品组对细胞活力有明显的抑制作用，中剂量组和低剂量组对细胞没有抑制作用。对于溶剂组来说，当溶剂的含量为10%时，具有细胞毒性，当溶剂的含量为1%，0.1%时，不具有细胞毒性。说明溶剂DMSO在浓度范围大于10%内具有细胞毒性。鉴于高剂量的提取物浓度或者高含量的溶剂具有HepG2细胞毒性或者对HepG2细胞具有明显的抑制作用，调整溶剂和确定提取物的浓度。

3.4提取物对细胞模型的影响

根据3.3节细胞活力的检测结果调整马比木根与茎提取物的浓度为0.2mg/mL，0.04mg/mL，溶剂DMSO的含量在1%以下，进行提取物的降糖活性检测。与空白组相比较，模型组中葡萄糖含量低于空白组显著高于胰岛素组;说明胰岛素抵抗模型造模成功;由图4可知，两个剂量组不管是提取物还是溶剂对细胞没有明显的抑制作用，细胞活力度良好，具有消耗葡萄糖的能力，进而葡萄糖的含量明显降低。从而可得出马比木根、茎提取物具有明显的胰岛素抵抗的降糖作用。马比木根、茎两部分提取物中剂量降糖活性高于低剂量，说明在一定范围内提取物的降糖活性呈剂量依懒性。根提取物的降糖活性高于茎提取物（图4）。马比木根中总黄酮的含量高于茎中，这与降糖作用结果一致;却与三萜含量大小关系相反。这一定程度说明黄酮的降糖作用高于三萜，但其降糖机制有待进一步研究。

4结论与讨论

本研究测定了马比木中总黄酮和总三萜的含量，发现其在马比木中的含量相当可观，但是也有所差别，在马比木不同的部位总黄酮和总三萜的含量不同，总黄酮在根中的含量高于茎中，总三萜的含量在根中的含量低于茎中。降糖模型中，样品组的细胞活力低于空白组不仅是溶剂DMSO的毒性，还有马比木提取物中有抗癌物质的存在，对癌细胞有杀伤作用，所以，样品组中细胞活力度低于空白组。马比木根茎提取物具有较好的降糖活性，其活性优于阳性药二甲双胍。由于总黄酮和总三萜在马比木不同部位的含量不同，两个部位的降糖活性也有所差别：总体来说根提取物的降糖活性优于茎提取物的降糖活性，这与总黄酮的含量高低呈正相关，从而说明总黄酮的降糖活性优于总三萜的降糖活性。根中总黄酮的含量几乎是茎中的两倍，但降糖活性无此线性关系，说明总三萜也具有一定的降糖活性，却无总黄酮的活性好。提取物中参与降糖活性的具体成分尚不明确有待进一步的研究。本研究对马比木的活动提供了补充，也为其资源的利用提供了新的思路。