刘永青+任琳+张子锋+任瑞+于红霞

摘    要：在单因素试验的基础上，利用曲面响应法对超声波辅助纤维素酶提取吕梁白蒿总黄酮提取工艺参数进行优化研究。首先利用正交试验优化纤维素酶解条件，然后选择超声波功率、超声波时间和超声波次数为自变量，总黄酮得率为响应值，采用Box-Behnken设计、Design Expert 7.0分析和二次回归多项式预测策略优化超声波条件。结果表明，超声波辅助纤维素酶提取白蒿总黄酮最佳工艺条件为超声波时间14 min，超声波提取3次，超声波功率396 W，酶解时间120 min，加酶量2.5%，酶解温度50 ℃，酶解pH 值5.5，其中超声波时间与次数的交互作用较强。白蒿总黄酮得率理论值为2.43%，实际值为2.47%。此方法优化吕梁白蒿中总黄酮提取效果良好。

关键词：吕梁白蒿;总黄酮;纤维素酶;超声波;响应曲面法

中图分类号：R284.2         文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.014

Ultrasonic Extraction of Flavonoids from Herb of Sievers Wormwood and its Optimization by Response Surface Method

LIU Yong-qing1， REN Lin1， ZHANG Zi-feng1， REN Rui2， YU Hong-xia1

（1.Luliang University， Luliang ， Shanxi 033000， China;2.Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taigu， Shanxi 030031， China）

Abstract： In this study， the response surface method on the base of single factor test was used to optimize the extract process of ultrasonic-assisted cellulase extraction of flavonoids from Luliang herb of sievers wormwood. After optimizing cellulase factors by the orthogonal experiment， the ultrasonic factors were studied with Box-Behnken design and polynomial quadratic equation predicting by Expert 7.0 analysis. The best solution was as follows： ultrasonic power 396 W， ultrasonic time 14 min， extracting 3times， 2.5% adding amount of enzyme， enzymolysis time of 120 min at 50 ℃ and pH 5.5. Under the optimized condition， the predicted and actual extraction rate of flavonoids were respectively 2.43% and 2.47%. Thereby the fitted multiple regression equation was credible.

Key words： Luliang herb of sievers wormwood; flavonoids; cellulase; ultrasonic; response surface methodology

白蒿（Herb of sievers wormwood）为菊科植物大籽蒿的幼嫩叶，又名茵陈。主要化学成分包括挥发油、多烯炔衍生物类、黄酮类、萜类化合物、微量香豆精和内酯类等[1]，其中黄酮类化合物具有抑菌、消炎、抗氧化等活性，可用作食品、化妆品行业的天然添加剂[2-3]。目前，从白蒿中提取黄酮类物质的工艺研究较少[4-6]，且常规方法提取总黄酮时间长，提取率低。纤维素酶可以高效酶解纤维素，加快黄酮类物质的溶出;超声波通过强烈振动产生空化效应，加速活性成分提取。本研究采用超声波辅助酶法技术提取吕梁白蒿中总黄酮，不仅能免去高温对提取成分的影响，缩短提取时间，还能充分利用吕梁本土资源，为进一步开发吕梁白蒿提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

白蒿采自吕梁学院，烘干粉碎干燥后备用;纤维素酶购自南宁庞博生物工程有限公司，酶活力为10万U·g-1;芦丁标准品购自上海金穗生物科技有限公司;其他化学试剂均为国产分析纯。

超声波清洗机（SB-3200DTDN），宁波新芝生物科技股份有限公司;紫外可见分光光度计（UV-1601）  北京瑞利分析仪器有限公司;微型高速万能试样粉碎机（FW80），北京中兴伟业仪器有限公司;电热鼓风干燥箱（GZX-9146MBE），上海博讯实业有限公司医疗设备厂;数显恒温水浴锅（HH-6），国华电器有限公司。

1.2 芦丁标准曲线绘制

称取芦丁10.00 mg，用60%乙醇配制得0.1 mg·mL-1芦丁标准溶液。分别量取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL上述芦丁标准溶液，定容至15 mL，加入1 mL 5%亚硝酸钠、1 mL 10%的硝酸铝、8 mL 4%的氢氧化钠，摇匀放置10 min，510 nm波长处测定其吸光值[7]，绘制标准曲线。

1.3 酶法提取总黄酮条件优化及含量测定

称取0.5 g白蒿粉末，溶于60%乙醇，加入纤维素酶摇匀酶解[8-9]，运用正交方法设计优化酶解条件，共选4个酶解因素，每个单因素选3个水平。单因素正交试验水平设计见表1。

试验结果按1.2方法测定吸光度值，按下列公式计算白蒿总黄酮得率[10]：

y=×100（1）

式中，y为白蒿的总黄酮得率（%）;m1为黄酮含量（mg）;m2为白蒿粉末质量（g）。

1.4 超声波辅助酶法提取的单因素试验

根据酶法优化结果，结合超声波提取进行试验。本试验以白蒿中黄酮得率为指标，选择超声波功率、超声波时间、超声波次数作为试验因素，进行单因素试验，确定最佳超声条件。

1.5 响应面分析试验设计

以单因素试验结果为依据，选择对总黄酮得率有显著影响的因素，运用Desigh Expert7.0软件设计试验[11-12]，并对试验数据回归分析。

2 结果与分析

2.1 绘制芦丁标准曲线

芦丁标准曲线见图1。标准曲线回归方程：Y=17.043X-0.018 6，相关系数R2 = 0.999 8，芦丁浓度在0～0.024 mg·mL-1线性较好。

2.2 酶法提取白蒿总黄酮条件优化

对加酶量、酶解时间、酶解温度和酶解pH值进行正交试验，方差分析见表2。结果表明，C与B高度显著，其次为D、A，由此可确定各因素的最佳水平为A2、B2、C3、D1，最佳组合为A2B2C3D1。当酶解时间120 min，加酶量为2.5%，酶解温度50 ℃，pH值为5.5时，该白蒿中总黄酮得率可达0.789%。

2.3 超声波辅助法优化提取白蒿总黄酮单因素试验

图2为不同超声波条件对黄酮得率的影响。当超声波功率小于400 W时，黄酮得率随超声波功率的增加而提高，超声波功率大于400 W时，黄酮得率逐渐下降，可能是过高功率破坏黄酮活性;黄酮得率随超声波时间延长而增加，当超过15 min时，黄铜得率开始降低，可能是提取出的黄酮随时间延长部分分解所致;黄酮得率随超声波次数增加逐步提高，当超过3次时提高不大，从经济和保护黄酮生物活性角度考虑，选择超声3次。通过单因素试验，初步确定了各因素的最优提取条件：超声波功率400 W，超声波时间15 min，超声波次数3次。

2.4 响应面分析设计方案与试验结果

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计方案，分别以超声波功率、超声波时间和超声波次数作为独立变量，-1、0、1分别表示变量水平。试验因素水平及编码表见表3，表中A、B、C为变量的编码值，白蒿黄酮的提取率为响应值见表4，利用Design Expert 7.0软件对数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程：

Y=2.40-0.07A-0.15B-0.12C+0.014AB-0.055AC-0.14 BC-0.35 A2-0.25 B2-0.16 C2            （2）

该方程的显著性检验结果见表5。

根据表5可知，整体数学模型P<0.01，失拟项为P>0.05，表明该方程对试验拟合性好，可以用该模型来分析和预测白蒿总黄酮提取工艺。方差分析结果显示模型中一次项B、C、交互项BC、二次项A2、B2、C2差异极显著; 一次项A差异显著;交互项AB、AC不显著，表明各因素对黄酮提取率的影响不是简单的线性关系。

根据回归分析结果做响应曲面图。当超声波次数为3次时，超声波功率与时间对黄酮得率的影响见图3。当超声波时间为15 min时，超声波功率与次数对黄酮得率的影响见图4;当超声波功率为400 W时，超声波时间与次数对黄酮得率的影响见图5，黄酮得率随超声波功率和时间的增加先增大后减小，黄酮得率随超声波次数的增加而增大。

综合上述分析结果，3个单因素对黄酮得率的影响大小为超声波时间>超声波次数>超声波功率，且超声波时间与超声波次数之间交互性较明显。软件Design-Export7.0确定的最佳提取工艺条件为超声波时间14.32 min，超声波提取次数为2.72次，超声波功率395.81 W，该条件下白蒿总黄酮的得率为2.43%。

2.5 验  证

为了验证响应面优化结果的可靠性，利用最佳优化条件进行试验。为保证试验可行性，按照超声波功率396 W，超声波时间14 min，超声波提取3次的条件进行，重复3次取平均值，白蒿总黄酮的得率为2.47%，与预测值相差不大，可见该回归方程的拟合性良好。

3 结论与讨论

本试验利用正交法结合响应面分析法，确定了提取吕梁白蒿中总黄酮的最佳条件为：超声波时间14 min，超声波提取3次，超声波功率396 W，酶解时间120 min，加酶量2.5%，酶解温度50 ℃，酶解pH值 5.5，其中超声波时间与超声波次数之间交互性较明显。白蒿总黄酮得率理论值为2.43%，实际值为2.47%。说明此方法优化吕梁白蒿中总黄酮提取效果良好。

在白蒿粉末的制备过程中，发现许多绒状纤维，当加入纤维素酶后发现总黄酮得率有较大提高。本研究通过4因素3水平正交试验优化酶法提取条件，在此基础上加入超声波辅助提取工艺，并运用响应曲面优化超声波条件。在为数不多的蒿类黄酮提取中[13-15]，超声波提取工艺居多，而超声波辅助酶法提取、响应曲面优化的工艺研究尚属首例。该工艺提取黄酮类物质简单、快速、效率高、破坏少，期望能为植物活性成分的进一步开发提供理论参考。

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