姚 兰 王春雷

1浙江中医药大学 浙江 杭州310053 2浙江省肿瘤医院 浙江 杭州310022

附子为毛茛科植物乌头的侧根，味辛，温，有大毒，归肾、脾经，始见于《神农本草经》。附子乃“回阳救逆第一品”，有补火助阳，散寒止痛之功，主治阴盛格阳，大汗亡阳，风寒湿痹，临床上常用于亡阳虚脱、肢冷脉微等。现代药理研究发现，附子具有强心、抗心律失常、抗血栓、抗肿瘤、免疫抑制等多方药理作用。附子化学成分复杂，主要分为生物碱类、多糖、脂质类等，其活性成分兼毒性成分为乌头碱、次乌头碱与新乌头碱。因而，限制了附子在临床上的应用。为了降低或消除附子毒性，前人采用各种炮制工艺，得到了多种加工品。黑顺片即为制附子中的一种，它保留了附子大部分药用成分，但药性温和。因此本实验选用黑顺片进行研究，探讨黑顺片对于骨性关节炎（OA）的治疗效果。

1 材料

1.1 实验动物：SD 大鼠40只，雌性，体重200±20g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016。大鼠饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心内，适应性饲养1周后开展实验。整个实验过程均在该实验中心SPF级屏障环境中完成。

1.2 试剂及仪器：IMDM 培养基（HyClone）、FBS 胎牛血清（Cellmax）、PBS 磷酸盐缓冲液（HyClone）、青链霉素混合液（Gibco）、碘乙酸（SIGMA-ALDRICH）、二型胶原酶（worthingyton）、EDTA 脱 钙 液（Solarbio）、TaKaRa Prime ScriptTM RT reagent Kit，YLS-3E 电子压痛仪（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司）、足底热辐射测痛仪（37370，意大利UGO BASILE）、MDF-J281AT 超低温冰箱（SANYO），DK-S12型恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）、SW-CJ-1F 层流超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、AXiovert200荧光倒置显微镜（Olympus ckx41）、全自动多功能酶标仪（BioTek）、CO2细胞培养箱（Thermo）。

2 方法

2.1 黑顺片水提物制备：取黑顺片（四川江油中坝附子科技发展有限公司，生产批号180702），参照先前的研究方法对黑顺片进行提取制备[1]。简单地说，将黑顺片磨成粉末，在10倍纯水中浸泡30min，加热回流提取30min。过滤后收集水提液，残渣加入8倍水，继续加热回流30min。过滤收集第2次水提液。合并两次煎液，真空减压加热浓缩1g/ml，水煎液以5000r/min 离心10min，取上清液即得。

2.2 高效液相测定黑顺片水煎液中的3种生物碱：精密称取新乌头碱、乌头碱、次乌头碱标准品，加入二氯甲烷定容，充分摇匀溶解作为对照品溶液。取“2.1”中制备的黑顺片水提液，制备成供试品溶液。色谱条件：Hypersil-BDS 柱（250.0mm×4.6mm，5.0μm）；以甲醇-水-氯仿-三乙胺（100：50：3：0.15）为流动相，流速：1ml/min，柱温30℃，进量样5μl。分别取适量标准品和供试品溶液进行检测。

2.3 大鼠原代软骨的分离提取：取3周龄SD 大鼠脱颈处死，置于75%酒精中浸泡5min。将取出的膝关节置于PBS 中洗净。无菌条件下，用手术刀片分离出软骨关节面。分离出的软骨用PBS清洗3次后，用手术剪将其剪碎至1mm3大小，装入试管中。先用0.25%胰蛋白酶37℃水浴消化30min，后换0.20%二型胶原酶消化4h，每30min振荡1次。终止消化，采用DMEM培养液，加入10%胎牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100u/ml。用70μm细胞筛网过滤，滤液离心，弃上清。将得到的细胞团块重悬后，接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中培养，观察贴壁情况，换液传代后备用。

2.4 造模及给药处理：将30只SD 大鼠随机分为空白组、OA 模型组、黑顺片治疗组（200μg/ml），每组10只。OA 模型组、黑顺片治疗组大鼠通过向双侧膝关节腔内各注射25mg·ml-1碘乙酸50μl 进行OA 造模，对空白组大鼠双侧膝关节腔内各注射25mg/ml 生理盐水50μl。造模1周后，向黑顺片治疗组大鼠双侧后肢膝关节腔分别注射50μl黑顺片水提物，向空白组和OA模型组大鼠膝关节腔注射等量生理盐水，每周1次，共注射4次。4周后，处死大鼠，进行取样分析。

2.5 检测指标：分述如下。

2.5.1MTT：取2代大鼠原代软骨细胞，消化计数，调整细胞浓度为1.5×104/ml，接种到96孔板中，置于37℃培养箱中进行培养。待细胞贴壁后，进行药物干预。设置空白组，多浓度梯度黑顺片水提物组（分别为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml）。24h后，采用MTT法检测细胞活性，并绘制细胞增殖曲线。

2.5.2压痛实验：应用YLS-3E 电子压痛仪测定大鼠的痛阈。将大鼠装入固定桶内，使动物处于舒适又起固定作用的状态，用扁型头对大鼠双侧后足背施压，当动物因疼痛出现鸣叫或挣扎时显示的压力值即为此动物的痛阈值。实验开始前测定基础痛阈，于造模后的第4周测定痛阈。

2.5.3热痛实验：应用足底热痛敏测试仪检测大鼠双侧后足趾热痛阈值。测量时，将大鼠置于透明有机玻璃箱内，室温保持在25±2℃。大鼠安静后（停止梳理毛发和探索性活动），将测试仪上的“十”字形标记置于大鼠左后跖足底中央并避开足垫。开启仪器，从开始至大鼠出现抬腿回避的时间作为大鼠的热痛阈值。每只脚照射3次，每次间隔5～6min。为防止大鼠被热辐射烫伤，我们将热痛阈值测定的时间上限值设定为20s，温度上限值设定为35℃。实验于每次压痛实验后的6h进行测定。

2.5.4组织病理学：造模后4周，将所有大鼠处死，取出膝关节，4%多聚甲醛固定48h，然后用EDTA脱钙4周。脱钙完成后，酒精逐级脱水，石蜡包埋，切片取样。切片常规脱蜡至水，经蒸馏水冲洗后进行番红O染色、封片。光镜下观察组织病理学改变。参照Mankin’s 软骨组织学评分标准进行Mankin’s评分。

2.6 统计学方法：实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示，采用SPSS20.0进行多重比较分析。大鼠的痛阈值检测、Mankin’s 评分、吸光度总体比较均采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD 检验，两两比较均采用student-t检验，检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 高效液相色谱图：取供试品进样检测，所得色谱图如图1所示。

图1 水煎30min黑顺片HPLC色谱图

3.2 MTT 细胞活性：黑顺片水提物直接作用大鼠原代软骨细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。从图224h、48h 细胞增殖曲线可知，当黑顺片水提物浓度为200μg/ml 时，大鼠原代软骨细胞的增殖率达到峰值。当水提物浓度低于200μg/ml时，其对原代软骨细胞的增殖率呈依赖性增长；当水提物浓度高于200μg/ml时，其增殖作用有所下降。水提物浓度为1000μg/ml时，在作用24h 后，对大鼠原代软骨细胞无明显增殖效果。黑顺片水提物对细胞处理时间达到48h，在800μg/ml时，增殖率为0；当水提物浓度为1000μg/ml时，出现了抑制大鼠原代软骨细胞生长的效果。

3.3 压痛阈值和热痛阈值检测结果：疼痛行为学指标检测结果如图3所示，3组大鼠的压痛、热痛阈值比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。与正常组相比，碘乙酸模型组的压痛阈值和热痛阈值低于正常组，证明大鼠疼痛骨性关节炎模型制备成功。经黑顺片水提物的治疗，其压痛阈值和热痛阈值显著提高（P＜0.01），有效缓解大鼠的疼痛。

图2 不同浓度黑顺片水提物对软骨细胞作用结果

图3 大鼠热痛阈值和压痛阈值

3.4 病理学结果与Mankin’s评分结果：如图4所示，对照组大鼠膝关节面光滑完整，软骨细胞排列规整，软骨下骨中骨小梁形态及分布正常。而在OA 模型组的大鼠膝关节发现严重的关节退变，伴随着关节软骨丧失，软骨细胞损失，胶原破坏。与模型组相比，黑顺片治疗组有效地逆转了这种损伤，软骨面光滑完整，软骨细胞排列整齐。

相应的Mankin’s 评分结果显示，正常组得分低于模型组（P＜0.01），黑顺片治疗组得分也低于模型组（P＜0.01），如图5所示。

图4 大鼠膝关节软骨组织病理切片（番红染色×100）

图5 大鼠膝关节软骨组织病理Mankin’s评分

4 讨论

中医学认为，OA 属于“骨痹”“痛痹”范畴，肝肾阳虚是本病发病基础之一，风寒湿邪侵袭及跌扑扭伤为发病诱因。因此，治疗骨性关节炎的关键在于补肾扶阳、驱寒除湿[2]。《神农本草经疏》言“附子，药性大热而善走，故亦善除风寒湿三邪，三邪祛则诸证自疗矣”。黑顺片是附子最常见的炮制品，被广泛应用于临床，主要用于散寒止痛、抗关节炎等。本实验中，黑顺片经过减毒处理，使其毒性大大降低，但依旧保留其有效成分。实验观察黑顺片水提物对大鼠软骨细胞的活性影响，发现黑顺片水提物对大鼠软骨细胞有较强的促增殖作用，且存在峰值，即200μg/ml。大于800μg/ml高浓度的黑顺片水提物出现抑制的作用，可能是水提物中的有毒成分含量过高，作用时间过长导致。此结果为附子解毒后的安全范围、作用时间提供了依据，提示了在应用黑顺片过程中，应兼顾用药剂量和用药时间。

碘乙酸诱导的大鼠模型是一种微创且成模块的骨性关节炎模型，再现了组织形态学和功能关节损伤以及类似人类的疼痛行为。通过关节腔注射不同剂量的碘乙酸，可人为控制模型中骨性关节炎病变的严重程度。通过关节腔注射法注射适量碘乙酸后，大鼠机械痛和热痛的阈值明显下降，由此确定成功制备疼痛骨性关节炎模型。关节腔注射给药是一种常见的给药方式，临床上用于治疗骨性关节炎、关节创伤等症，该方法极大地改善胃肠道不良反应，提高生物利用度。药物直接作用靶点的同时，也提高了用药安全性。本研究中，利用碘乙酸模型确定黑顺片水提物对大鼠骨性关节炎的治疗作用。实验采用关节腔注射给药的方式，可以大大降低黑顺片对大鼠产生的毒性影响，且治疗靶点明确。结果显示，黑顺片治疗组的软骨破坏程度减轻，软骨细胞损失减少。根据疼痛结果显示，黑顺片能有效提高膝关节炎的痛域。提示黑顺片可以修复受损关节软骨，恢复关节功能，有效减轻OA寒湿痹阻证大鼠的膝关节疼痛症状，且效果显著。

黑顺片水提物中抗OA 作用的有效成分还需要进一步研究。对于黑顺片保护软骨细胞，促进软骨再生，以及受损关节软骨修复过程和机制还未可知，需要深入探讨。