米雪，刘树兴，曾桥,2,3*，徐丹

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021；2.陕西科技大学 轻工科学与工程学院，西安 710021；3.陕西农产品加工技术研究院，西安 710021)

柿子树为柿科柿属落叶大乔木，生长在热带和温带地区。我国是柿子树的主要种植区，柿子年产量占全世界的50%以上[1]，主要分布于陕西、山东、河南等地。柿子营养丰富，产量巨大，有数据表明，2016年我国柿子产量达396万吨。柿子成熟后不易长期保存，除鲜食外，大部分被进一步深加工制成柿饼、柿干、浓缩柿子汁等。柿皮是柿子深加工过程中的主要副产物，约占柿子重量的10%[2]，近年来，随着柿子产业的快速发展，因大量的柿皮未被有效地处理而对环境造成了较为严重的污染，越来越被大家重视。研究表明，柿皮中含有较多的多酚、膳食纤维、果胶物质、单宁以及类胡萝卜素等活性成分[3-5]，具有进一步开发的潜力。综合利用柿子皮，不仅可以提高柿子加工产品的附加值，而且可以实现柿子加工副产物的减量化和资源化，对于环境保护具有重要意义。

类胡萝卜素是一系列化合物，是比较常见的自然色素的合称[6]，为脂溶性色素，呈黄色、橙色和红色[7]，只能由植物和微生物合成。研究表明，类胡萝卜素的抗氧化和抗炎活性较好，具有增强免疫力[8]、抗癌、预防心血管疾病、保护视觉和防止老年性黄斑变性等功能[9]，是一种极具发展前途的功能性天然色素，可作为抗氧化剂、着色剂、膳食补充剂等用于食品和调味品中[10]。而柿皮中类胡萝卜素含量较为丰富，为了充分利用这一资源，本文对柿皮中类胡萝卜素的提取工艺和抗氧化活性进行了研究，从而为我国丰富的柿皮资源化利用提供了理论依据，以期促进柿子产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柿皮：由富平永辉现代农业柿子产业园提供。

β-胡萝卜素标准品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、ABTS二胺盐：上海源叶生物科技有限公司；碳酸氢二钠、石油醚、碳酸二氢钠、铁氰化钾、乙酸乙酯、抗坏血酸、无水乙醇、30%双氧水、三氯化铁：天津科密欧化学试剂有限公司；丙酮、水杨酸：国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1004N型电子分析天平 上海上天精密仪器有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；600型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；RE52CS-1型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；KH5200DE型超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；GZX-9246MBE型电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

将新鲜柿皮冷冻干燥，取出切成小块，粉碎过20目筛，备用。

1.3.2 β-类胡萝卜素标准曲线的绘制

精确称取β-胡萝卜素标准品5 mg，溶解于丙酮中，定容至100 mL，制备成浓度为50 μg/mL的β-胡萝卜素标准液。分别吸取5，10，15，20，25 mL标准液至50 mL容量瓶中，用丙酮定容，制备成浓度分别为5，10，15，20，25 μg/mL的标准工作液，在450 nm处测量吸光值，并绘制标准曲线。得回归方程为Y=0.0227X+0.0048，R2=0.9996，线性关系良好。

1.3.3 类胡萝卜素的提取

精确称取柿子皮粉1 g，置于100 mL具塞三角瓶中，固定超声功率为100 W，按一定液料比加入提取溶剂，在一定温度下超声辅助提取一定时间后，抽滤得柿皮类胡萝卜素粗提液，定容，稀释至一定倍数，在450 nm处测得吸光度值，进行3组平行试验，按(1)式计算类胡萝卜素含量。

(1)

式中：C为类胡萝卜素的浓度，μg/mL；V为溶液体积，mL；N为稀释倍数；m为样品质量，g。

1.3.4 单因素试验设计

提取溶剂的选择：固定液料比为20∶1 (mL/g)，提取温度为50 ℃，超声辅助提取40 min，分别考察丙酮、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚作为提取溶剂对类胡萝卜素提取率的影响。超声温度的选择：用无水乙醇作为提取溶剂，固定液料比为20∶1 (mL/g)，超声辅助提取40 min，分别考察提取温度为30，40，50，60，70 ℃时对类胡萝卜素提取率的影响。超声时间的选择：以无水乙醇作为提取溶剂，固定液料比为20∶1 (mL/g)，温度为50 ℃，分别考察超声提取时间为10，20，30，40，50 min时对类胡萝卜素提取率的影响。液料比的选择：以无水乙醇作为提取溶剂，固定超声提取温度为50 ℃，提取时间为40 min，分别考察液料比为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 (mL/g)时对类胡萝卜素提取率的影响。

1.3.5 响应面试验设计

在单因素试验基础上，固定提取溶剂为无水乙醇，超声功率为100 W，选择超声温度、超声时间和液料比3个因素，采用Design Expert 8.0.6软件进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验设计，因素和水平设计见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素和水平表

1.3.6 柿皮中类胡萝卜素抗氧化活性评价

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性测定[11]

精确称取DPPH粉末5.0 mg，以无水乙醇为溶剂配制成0.05 mg/mL的DPPH对照溶液。于试管中依次加入质量浓度分别为5，10，20，30，40，50 μg/mL的柿皮类胡萝卜素溶液2.00 mL和DPPH溶液2.00 mL，震荡均匀后在28 ℃下水浴30 min。以无水乙醇调零，于517 nm处测定吸光度，记为A样品，用无水乙醇代替DPPH溶液按以上方法测定吸光度，记为A对照，用无水乙醇代替柿皮类胡萝卜素提取液按以上方法测定吸光度，记为A空白。DPPH 自由基清除率计算公式如下：

(2)

1.3.6.2 ·OH清除活性测定[12]

于试管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL，2 mL质量浓度分别为5，10，20，30，40，50 μg/mL的柿皮类胡萝卜素提取液，2 mL浓度为6 mmol/L的H2O2溶液，震荡均匀，静置10 min，加入2 mL浓度为6 mmol/L的水杨酸溶液并摇匀，静置30 min，以蒸馏水调零，于510 nm 处测定各梯度浓度下溶液的吸光度，记为A样品，按上述方法用蒸馏水代替柿皮类胡萝卜素提取液测定吸光度，记为A空白，用蒸馏水代替水杨酸按上述方法测定吸光度，记为A对照，并按公式(3)计算·OH清除率，同时，以Vc作为阳性对照。

(3)

1.3.6.3 ABTS+清除活性测定[13]

于试管中依次加入质量浓度为5，10，20，30，40，50 μg/mL柿皮类胡萝卜素提取液0.5 mL，含ABTS+的溶液4.0 mL，静置6 min。以无水乙醇调零，在734 nm处测定吸光度A样品；用无水乙醇代替柿皮类胡萝卜素提取液按以上方法测定吸光度A空白；Vc作为阳性对照。按下式计算ABTS+清除率：

(4)

1.3.6.4 还原力测定[14]

取质量浓度分别为5，10，20，30，40，50 μg/mL的柿皮类胡萝卜素提取液0.5 mL，依次加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，摇匀后置于50 ℃水浴中反应20 min，进一步加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL、蒸馏水5 mL和0.1%氯化铁溶液1 mL ，震荡均匀后静置10 min，以无水乙醇代替柿皮类胡萝卜素提取液作空白对照，于700 nm波长处测定吸光度。

1.3.7 数据分析方法

本文所有试验均设置3次重复，数据为重复试验的平均值。响应面优化试验数据用Design-Expert 8.0.6软件进行二次回归分析及方差分析，其他试验结果均采用Origin 8.0软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 提取溶剂对柿皮类胡萝卜素提取的影响

类胡萝卜素具有疏水性，常使用有机溶剂进行提取，常见的包括丙酮、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚和己烷等，其中以丙酮和乙醇较佳[15]。

图1 提取溶剂对柿皮类胡萝卜素提取的影响

由图1可知，不同提取溶剂对类胡萝卜素提取效果的影响较为明显，以无水乙醇作提取溶剂时，柿皮类胡萝卜素含量最高；当乙酸乙酯作为提取溶剂时，柿皮类胡萝卜素含量最低。这是因为类胡萝卜素在不同的溶剂中具有不同的溶解度，因此提取效果也各不相同。无水乙醇作为常用溶剂，具有安全、成本低、粘性小、易回收等优点。因此，合适的提取溶剂为无水乙醇。

2.1.2 超声温度对柿皮类胡萝卜素提取的影响

图2 超声温度对柿皮类胡萝卜素提取的影响

由图2可知，温度逐渐升高，柿皮类胡萝卜素含量先增加后减小。当温度升高至50 ℃时，类胡萝卜素含量达到最大。温度越高，分子热运动越快，类胡萝卜素溶解速率越快，但温度过高，含量下降，这可能是由类胡萝卜素的不稳定性引起的，导致类胡萝卜素活性丧失，乙醇的蒸发速率增加且能量消耗增加。综合考虑，选取的超声温度为50 ℃，随后的响应面优化试验在40～60 ℃范围内进行。

2.1.3 超声时间对柿皮类胡萝卜素提取的影响

图3 超声时间对柿皮类胡萝卜素提取的影响

由图3可知，柿皮类胡萝卜素的含量随超声时间的增加而逐渐增加，在40 min达到最大值。进一步延长提取时间，类胡萝卜素含量反而下降，这可能是由于较长时间超声波作用过程破坏了类胡萝卜素[16]。因此，最佳超声时间为40 min，后续响应面优化试验在30～50 min范围内进行。

2.1.4 液料比对柿皮类胡萝卜素提取的影响

图4 液料比对柿皮类胡萝卜素提取的影响

由图4可知，柿皮类胡萝卜素含量随液料比的增加先增大后减小，在液料比30∶1 (mL/g)时，含量达到最大值，随后呈现下降趋势。因此，较佳液料比为30∶1 (mL/g)，后续响应面试验在液料比20∶1～40∶1 (mL/g)范围内进行。

2.2 柿皮类胡萝卜素提取工艺的优化

2.2.1 Box-Behnken中心组合试验设计及结果

选取超声温度(A)、超声时间(B)、液料比(C)进行三因素三水平共17组Box-Behnken响应面分析实验。方案设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken中心组合设计实验及结果

续 表

2.2.2 回归模型的建立及显著性分析

利用Design Expert 8.0.6软件对柿皮类胡萝卜素提取试验结果进行多元回归拟合，得到以柿皮类胡萝卜素含量为目标函数的二次回归方程：

Y=-2.41+0.099A+0.073B+0.040C-8.555×10-4AB+2.075×10-5AC+2.900×10-5BC-5.627×10-4A2-3.800×10-4B2-5.237×10-4C2。

表3 响应面数据分析表

注：“*”表示差异显著，P<0.05；“**”表示差异高度显著，P<0.01；“***”表示差异极显著,P<0.001。

由表3可知，模型的P值<0.001，表示回归方程极显著，失拟项P值为0.3311，不显著，说明该模型能够很好地拟合试验数据。回归方程决定系数R2=0.9603，调整决定系数RAdj2=0.9094，表明回归方程具有较好的拟合度。超声温度(A)、超声时间(B)、液料比(C)的一次项均达到了显著水平。影响因素由大到小顺序为：超声温度>超声时间>液料比。此外，超声温度(A)和超声时间(B)的交互作用、超声温度(A)、液料比(C)的二次项也达到了显著水平。

2.2.3 响应面优化分析

响应面曲面图和等高线图由Design Expert 8.0.6软件绘制，各因素交互作用的响应曲面图和等高线图见图5。

图5 各因素交互作用对类胡萝卜素提取含量影响的响应面和等高线图

经Design Expert软件优化，响应面优化模型预测柿皮类胡萝卜素最佳工艺条件为：超声温度60 ℃，超声时间30.29 min，液料比39.75∶1 (mL/g)，理论计算柿皮类胡萝卜素提取的最大含量为2.63 mg/g，考虑到实际操作的可行性和方便性，将最佳工艺参数调整为超声温度60 ℃，超声时间30 min，液料比40∶1 (mL/g)，在此条件下，进行平行3次验证试验，实测含量为2.58 mg/g，与预测值误差为1.9%，说明该模型对柿皮类胡萝卜素提取工艺的优化具有一定的实际应用价值。

2.3 柿皮类胡萝卜素体外抗氧化活性评价

2.3.1 对DPPH自由基的清除作用

图6 柿皮类胡萝卜素对DPPH自由基清除作用

由图6可知，随着浓度的增加，柿皮类胡萝卜素和Vc对DPPH自由基的清除率增加，当柿皮类胡萝卜素质量浓度大于20 μg/mL时，其对DPPH自由基的清除效果略高于Vc，且进一步提高柿皮类胡萝卜素的浓度，其清除能力增加缓慢，当柿皮类胡萝卜素质量浓度为50 μg/mL时，其对DPPH自由基的清除率可达96.5%，与同浓度下Vc的清除能力相当，说明柿皮类胡萝卜素清除DPPH自由基的能力较强。

2.3.2 对·OH的清除作用

图7 柿皮类胡萝卜素对·OH清除作用

由图7可知，对·OH的清除率随着柿皮类胡萝卜素和Vc浓度的增加而增加，当质量浓度达到50 μg/mL时，柿皮类胡萝卜素相较于Vc具有更好的清除能力，柿皮类胡萝卜素对·OH的清除率为46.5%，而Vc仅为32%，且类胡萝卜素对·OH的清除能力仍呈明显上升趋势，而Vc则较为缓慢。

2.3.3 对ABTS+的清除作用

图8 柿皮类胡萝卜素对ABTS+清除作用

由图8可知，随着柿皮类胡萝卜素和Vc质量浓度的增加，ABTS+清除率增加，当柿皮类胡萝卜素质量浓度为50 μg/mL时，其对ABTS+的清除率达93.4%，和相同浓度下的Vc清除能力相当。结果表明，柿皮类胡萝卜素清除ABTS+的能力较强。

2.3.4 还原力

图9 不同质量浓度柿皮类胡萝卜素还原力

由图9可知，柿皮类胡萝卜素和Vc的还原力随着质量浓度的增加而增加，柿皮类胡萝卜素的还原力明显强于Vc，当柿皮类胡萝卜素质量浓度为50 μg/mL时，吸光度为0.40，相同浓度下Vc的吸光度仅为0.17。

3 结论

响应面优化出柿皮中类胡萝卜素的最佳提取工艺为：超声功率100 W，提取溶剂为无水乙醇，提取温度60 ℃，提取时间30 min，液料比40∶1 (mL/g)，进行验证试验，测得含量为2.58 mg/g，与理论计算柿皮中类胡萝卜素的最大提取含量2.63 mg/g比较，误差仅为1.9%，具有实用价值。体外抗氧化试验结果表明，当柿皮类胡萝卜素浓度为50 μg/mL时，DPPH自由基的清除率为96.48%，略高于Vc；对ABTS+的清除率达93.35%，与Vc相当；50 μg/mL柿皮类胡萝卜素对·OH的清除率达46.54%，显著高于Vc；50 μg/mL柿皮类胡萝卜素对铁的还原力为0.40，显著高于Vc，说明柿皮类胡萝卜素具有较强的体外抗氧化活性。