吴 影 马雨浩 王亮飞 闫佳琦 赵超亚 李长福 古绍彬，2，3*

（1 河南科技大学食品与生物工程学院 河南洛阳 471023）

2 河南省食品微生物工程技术研究中心 河南洛阳 471023）

3 食品加工与安全国家级实验教学示范中心 河南洛阳 471023）

蜗牛黏液是蜗牛爬行过程中足腺分泌出的光滑黏液，它可让静止的软体动物吸附在岩石表面，形成暂时的封闭结构[1]。在运动中，黏液使足部保持湿润，减少腹足肌肉与地面直接摩擦，避免蜗牛爬行时受到损伤。在捕食中，蜗牛黏液可以帮助蜗牛将食物从触角转运到嘴处，净化被唇和触角抛弃的食物，通过分泌黏液来保护自身免受水生食肉动物的捕食，还可以保护自身免于水分的蒸发[2]。在冬眠或夏眠时，蜗牛足腺分泌出来的黏液，干涸后在壳口形成一个薄膜，把身体严密地封闭起来，待外界环境适宜时即破膜而出重新修复身体[3]。

蜗牛黏液含丰富的天然胶原质、弹力蛋白、尿囊素、蛋白质、多种维生素、甘醇酸、天然的抗菌剂[4]。胶原蛋白是皮肤重要结缔组织成分，具有保持水分的功效。弹力蛋白，保持皮肤组织的弹性蛋白，适当补充弹力蛋白可防止皱纹提早出现。尿囊素，有效修补伤痕，帮助皮肤对抗自由基，具保湿、伤口愈合、抗发炎、剌激细胞再生及舒缓的作用，是皮肤柔软剂和抗氧化剂[5]。葡（萄）糖醛酸，可使肌肤表皮表层的黏胶性脂质松软，以利于去除老旧角质，加速细胞再生，减少皮肤皱纹及疤痕。此外，黏液还是一种天然抗生素，能够杀死皮肤上的某些细菌，并能消除皮肤斑点和痤疮，这是因为它能渗透到皮肤的第3个层面[6]。从蜗牛黏液中提炼出的尿囊素可以使皮肤再生；蛋白质和维生素可以增加皮肤的营养，使肌肤更加细腻和光滑。此外，研究还发现蜗牛黏液有抗氧化活性，其包含许多SOD酶、谷胱甘肽、转硫酶和低分子质量的能还原ABTS的抗氧化物质[7]；同时还与细胞再生和保护相关的FGF活性存在有关[8]。

蜗牛作为高蛋白、低脂肪的上等食品和动物性蛋白饲料，被广泛利用，促进了蜗牛养殖业的不断发展[9-10]。然而，现有技术中，蜗牛黏液是在蜗牛肉中提取的，是加工蜗牛肉时的副产品。蜗牛在沸水中瞬间死亡，其受到刺激分泌的黏液无法保存分离，且获取蜗牛黏液时经过长时间的高温处理，既破坏了黏液有效成分，也影响其中一些活性物质的功效[11-12]。天然的蜗牛黏液分泌量非常稀少，造成市场上添加蜗牛黏液相关的产品价格居高不下。目前蜗牛黏液的提取技术有限，产品杂质多且保存条件高，使得蜗牛黏液的应用受限。本文研究从活体蜗牛中提取具有活性成分的黏液及其特性，对其后续的成分分析和产品开发具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌：产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli）、志贺氏菌（Shigella）、猪沙门氏菌（Salmonella suis）、禽巴氏杆菌（Pasteurella multocida）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由河南科技大学食品与生物工程学院微生物学教研室保存。

培养基：LB培养基。

原料：白玉蜗牛，洛阳绿尔农业科技有限公司。

试剂：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，北京保顺科技有限公司；浓硫酸、氯胺T、对二氨基苯甲醛、酵母粉、胰蛋白胨、琼脂、乙醇等生化试剂，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

K9860凯氏定氮仪，济南海能仪器有限公司；Vertex 70红外光谱仪，Bruker公司；UV2600紫外-可见分光光度计，岛津国际贸易（上海）有限公司；LGJ-10D型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蜗牛黏液的制备 挑选质量在25 g以上的鲜活蜗牛，清水洗净、晾干。取出蜗牛，用去针头的1 mL注射器吸取质量分数5%～25%的5个梯度NaCl溶液各1 mL，均布浸涂在蜗牛腹足部，静置0.5～2 min，使蜗牛腹足部分泌的黏液流至收集器皿中；之后立即用清水冲洗蜗牛。分泌黏液后的蜗牛需补充清水和精饲料饲养5 d后方可再次提取黏液。将提取的黏液过陶氏纳滤膜（NF200）除去水和氯化钠，再加水冲洗几次，确保氯化钠被去除干净，再次过NF200纳滤膜，浓缩黏液。将纯化的黏液倒入平皿中，用保鲜膜封口并用锐器戳适量小孔透气，将其放入真空冷冻干燥箱中降温，待温度降至-50℃，将物料放入，抽真空，当真空度<10 Pa时，关闭真空泵，真空冷冻干燥处理3～5 h，得到白色粉状物。

1.3.2 粗蛋白含量测定（凯氏定氮法）将1 g样品移入250 mL三角瓶中，加入0.2 g硫酸铜、6 g硫酸钾、20 mL浓硫酸，摇匀，小火加热使其炭化，待瓶内液体变为澄清透明绿色溶液，冷却后移入100 mL容量瓶中，定容后于K9860凯氏定氮仪中进行蛋白含量测定。同时做空白对照。

1.3.3 胶原蛋白含量测定 胶原蛋白含量测定采用 Woessner法[13]。 参照 ISO3496（E）法[14]绘制羟脯氨酸标准曲线。

羟脯氨酸标准曲线的建立：称量50 mg羟脯氨酸标准品，溶解后移入100 mL容量瓶，滴加1滴3 mol/L硫酸，定容。吸取10 mL标准储备液于1 000 mL容量瓶中定容，得到5 μg/mL标准储备液。按表1加羟脯氨酸标准工作液，定容至100 mL，取 4 mL于具塞试管中，加入2 mL氯胺T摇匀，室温放置20 min。加入2 mL显色剂摇匀，水浴锅中60℃加热20 min。冷却后放置30 min，在波长558 nm处测吸光值。以羟脯氨酸溶液浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标建立羟脯氨酸标准曲线。

表1 羟脯氨酸标准曲线加样体系Table1 Addition system of hydroxyproline standard curve

样品中羟脯氨酸含量测定：取冻干蜗牛黏液样品1 g，用6 mol/L盐酸在115℃烘箱中水解8 h，加入柠檬酸缓冲液定容100 mL。取4 mL溶液于具塞试管中，按绘制羟脯氨酸标准曲线步骤测定样品中羟脯氨酸含量。样品中羟脯氨酸含量按公式（1）计算。

式中，m——提取出的羟脯氨酸含量，mg/g；C——标准曲线上相应的羟脯氨酸质量浓度，μg/mL；M——称取样品质量，g；F——稀释倍数。

1.3.4 胶原蛋白的提取

1）酶解法[15-17]胃蛋白酶：取10 g蜗牛黏液于小烧杯中，按照1∶5料液比添加50 mL缓冲液，加入0.5 g胃蛋白酶，充分搅拌后在室温放置48 h酶解，沸水浴10 min灭酶。

胰蛋白酶：取10 g蜗牛黏液于小烧杯中，按照1∶5料液比添加50 mL缓冲液，加入0.5 g胰蛋白酶，充分搅拌后室温放置48 h酶解，沸水浴10 min灭酶。

木瓜蛋白酶：取10 g蜗牛黏液于小烧杯中，按照1∶5料液比添加50 mL蒸馏水，加入0.5 g木瓜蛋白酶，充分搅拌后室温放置48 h酶解，沸水浴10 min灭酶。

2）酸解法[18，20-21]取10 g蜗牛黏液于小烧杯中，按1∶5料液比添加50 mL蒸馏水，加入1.05 g柠檬酸（0.1 mol/L），充分搅拌后在4℃冰箱中放置72 h酸解。

3）水提法[19-21]取10 g蜗牛黏液于小烧杯中，按照1∶5料液比添加50 mL蒸馏水，于70℃水浴锅中加热6 h。

将处理好的黏液分装于5 mL离心管中，12 000 r/min转速离心15 min，取上清液于平皿中，置于真空冷冻干燥箱中冻干处理。

1.3.5 蜗牛黏液胶原蛋白的定性分析 紫外-可见吸收光谱法[21]：将酶解法、酸解法和水提法获得的样品冻干后溶解于0.5 mol/L冰乙酸溶液中，设定波长范围190～400 nm，将0.5 mol/L冰乙酸溶液倒入石英比色皿中调零，加入待测样品测定吸光值。

红外光谱法[22]：将酸解法冻干后样品放入60℃烘箱中全干燥，取1 mg与干燥的100 mg溴化钾在玛瑙研钵中研磨使颗粒达到2 μm。将混合物均匀放入固体压片模具的顶模和底模间，将模具放入压力机，在15 MPa压力下保持1 min，得到透明或均匀半透明锭片。将锭片取出，放入固体样品测试架中测试。

1.3.6 高效液相色谱成分分析 取新鲜蜗牛黏液1.25 mL溶解到 25 mL流动相（pH 2.7的10 mmoL/L磷酸二氢钾）中，混匀，60℃加热20 min，冷却后用10 moL/L氢氧化钾调节pH值至2.9，混匀2 min，用等体积正己烷提取样品，待分层后吸取下层样品溶液用0.22 μm有机滤膜过滤。磷酸氢二钾（C）和乙腈（D）为流动相，采用梯度洗脱法，将乙腈体积分数由0增加至70%，流速为0.7 mL/min。

1.3.7 蜗牛黏液抑菌性试验 每皿培养基加0.10 mL供试菌菌悬液，涂匀后，置于 3个牛津杯。将蜗牛黏液的冻干样品0.2 g充分溶解在4 mL水中，用移液枪吸取200 μL，分别注入牛津杯。37℃培养24 h后观察、记录。每组重复 3次。

2 结果与分析

2.1 活体蜗牛黏液的制备

分别用质量分数5%，10%，15%，20%，25%梯度的NaCl溶液浸涂于蜗牛腹足部，发现5个质量分数的NaCl均可刺激蜗牛分泌黏液（见表2），其中20%的NaCl处理蜗牛获得的黏液量最大，达蜗牛自身体重的30%左右。

表2 NaCl质量分数对蜗牛黏液分泌量的影响Table2 Effect of NaCl concentration on mucus secretion of snails

2.2 蜗牛黏液粗蛋白含量的测定

用凯氏定氮仪测得白玉蜗牛新鲜黏液中的粗蛋白含量为0.42%，而冻干样品中粗蛋白含量为31.48%。文献报道，猪皮的粗蛋白含量为24.59%，鱿鱼皮的粗蛋白含量为11.13%，冻干后粗蛋白含量为56.23%，海蜇皮中粗蛋白含量为1.82%。可以看出蜗牛黏液中粗蛋白含量适中，具有一定的研究价值。

2.3 蜗牛黏液中胶原蛋白的定性分析

在蛋白质的氨基酸中，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸具有共轭双键它们在280 nm处有较强的吸收峰，在测蛋白质浓度时常采用紫外分光光度法。胶原蛋白的结构较特殊，组成它的氨基酸中几乎不含共轭双键的氨基酸，在280 nm处无吸收峰，而在220～230 nm处有明显的吸收峰。通过此特征可以鉴定样品中是否存在胶原蛋白。

由图1可见，图1a～1e在230 nm处均存在最大吸收峰，说明蜗牛黏液中存在胶原蛋白。图1a～1d在其它波长处也存在吸收峰，可能是由于酶解法和水提法提取胶原蛋白不彻底，仍存在其它杂蛋白，或者灭酶处理不彻底等。酸解法处理的蜗牛黏液，在波长230 nm处存在显著的吸收峰，在其它波长处没有吸收峰，表明酸提法、酶解法和水提法相比可从蜗牛黏液中获得较纯的胶原蛋白。

图1 蜗牛黏液紫外吸收光谱图Fig.1 Ultraviolet absorption spectra of snail’s mucus

Ⅰ型胶原蛋白为各种动物体内胶原蛋白的主要存在形式，为了分析蜗牛黏液中的胶原蛋白类型，采用红外光谱法对酸解获得的样品进行扫描，结果表明，3 404 cm-1处存在峰值是由于氮氢键之间发生的伸缩振动，说明该处有氢键；有强烈的O-H伸缩振动峰，表明有羟基结构。1 652 cm-1处存在峰值是由于酰胺Ⅰ带间的碳氧单键发生伸缩振动，1 540 cm-1处存在峰值是因为在附近的酰胺Ⅱ带中氮-氢间发生弯曲状波动，表明存在乙酰氨基结构。1 125 cm-1处有吸收峰表明胶原蛋白结构中三股螺旋完整。以上多种吸收峰的存在表明蜗牛黏液中的胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白。将图2与标准sigmaⅠ型胶原蛋白红外图[22]相比，均有Ⅰ型胶原的特征峰，表明蜗牛黏液中的胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白。

2.4 胶原蛋白含量

白玉蜗牛分泌液的冻干样品在长时间的高温、强酸环境中，其胶原蛋白会变性、解离，变成可检测的游离氨基酸。其中，羟脯氨酸为胶原蛋白中的特征性氨基酸，作为检测标准。通过woessenr法处理，用紫外-可见分光光度计在558 nm处测羟脯氨酸标准溶液的吸光值，制备标准曲线，见图3。

根据标准曲线推测出羟脯氨酸含量，由公式（1）即可得出冻干样品中所含羟脯氨酸的量。目前有关白玉蜗牛分泌液中胶原蛋白的研究较少，还没有一个关于胶原蛋白和羟脯氨酸之间的标准换算系数。本文采用的换算系数为11.1（参考海蜇胶原蛋白的测定[21]）。经测定，冻干样品中羟脯氨酸含量为15.04 mg/g，经换算，胶原蛋白含量占冻干样品总重的16.69%。上文凯氏定氮法测得冻干样品中蛋白质含量为31.48%，胶原蛋白占总蛋白的53%。与其它文献相比，胶原蛋白含量较少。其原因可能是处理冻干样品时的水解时间较短，羟脯氨酸没有完全从中分离出来。

图2 蜗牛黏液的红外光谱图Fig.2 Infrared spectroscopy of mucus from snail

2.5 黏液主要成分分析

图3 羟脯氨酸标准曲线Fig.3 Standard curve of hydroxyproline

通过高相液相色谱法分析蜗牛黏液成分和其所含活性因子。图4中有两个较明显的峰值，这与Mubarak等[23]做出的色谱图大致相同。根据尿囊素和乙醇酸的特性，以及尿囊素的极性大于乙醇酸，尿囊素的出峰时间比乙醇酸早，由此得出第1个峰为尿囊素，第2个峰为乙醇酸（如图5a和5b）。Mubarak等[23]作出的光谱图中，尿囊素峰值高于乙醇酸，而本次分析相反，这可能是因蜗牛种类不同而导致各成分浓度的差异。

2.6 蜗牛黏液抑菌活性

采用牛津杯法测定了蜗牛黏液对5种供试菌的抑制效果（见表3）。蜗牛黏液对志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、猪沙门氏菌、产毒大肠杆菌和禽巴氏杆菌的生长均有一定的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的抑菌圈较大，抑菌效果较强；对猪沙门氏菌有一定抑制作用，对禽巴氏杆菌抑菌作用较弱，而对产毒大肠杆菌没有抑菌效果。由此得出蜗牛黏液中所含某些活性成分对所测试菌株均具有抑菌性。Zhong等[24]在非洲大蜗牛中发现一种新的富含半胱氨酸的抗菌肽，与本研究结果相近。白玉蜗牛体内是否含有新型抑菌成分仍需进一步研究。

图4 蜗牛粘液高相液相色谱图Fig.4 High phase liquid chromatography of snail’s mucus

图5 高效液相全波长扫描图Fig.5 Full wavelength scanning map of high performance liquid chromatography

表3 蜗牛黏液抑菌活性Table3 Antimicrobial activity of snail’s mucus

3 结论

本文利用NaCl刺激法在活体蜗牛中获得大量的白玉蜗牛黏液，约占蜗牛自身体重的30%。对黏液的组成成分进行测定，发现蜗牛黏液中粗蛋白含量为0.42%，冻干样品中的粗蛋白含量为31.48%。利用紫外-可见分光光度法测定表明蜗牛黏液中含有胶原蛋白，红外光谱扫描表明蜗牛黏液中存在Ⅰ型胶原蛋白。借助 Woessner法测得白玉蜗牛黏液中胶原蛋白含量为16.69%。此外，通过高效液相色谱分析，发现黏液中含大量的活性物质，如尿囊素、乙醇酸小分子抗氧化类物质。抑菌试验结果表明：获得的活体蜗牛黏液对志贺氏菌、猪沙门氏菌、禽巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。张甜甜等[2]研究蜗牛黏液的抗氧化活性，发现蜗牛黏液中的抗氧化类物质对温度有较好的稳定性，可应用于抗氧化的保健食品。另外，蜗牛黏液的提取物具有尿囊素、乙醇酸等保湿活性物质、修复细胞因子和抗衰老类活性物质，可将蜗牛黏液应用于化妆品等用品中。Zhong等[24]研究发现蜗牛黏液中含有富含半胱氨酸的抗菌肽，对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌和真菌白色念珠菌均有抑菌活性，且对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，最小肽质量浓度（MIC）为1.9 μg/mL。蜗牛黏液不仅在化妆品领域，在食品和药品领域都有较高的研究和利用价值。