范方媛 徐鹏程 李春霖 龚淑英* 金 晶 陆德彪

（1 浙江大学茶叶研究所 杭州 310058

2 浙江省农业技术推广中心 杭州 310020）

龙井茶是我国著名的名优绿茶，是浙江省名优茶的典型代表，国家质监总局在2001年将其批准为地理标志保护产品。随着地理标志的逐步规范与增强，不同产区龙井茶的品质差异化受到关注，龙井茶的产地判别也成为焦点之一。由于各产区的地理条件相似且有相互交错，采用的“龙井茶”生产加工方式又十分相似，从外形、香气、滋味等方面判别龙井茶产区具有较大难度。

指纹图谱作为国际公认的产品质量评价手段，已在药材、食品[1-2]等领域中有较为充分的体现。该方法目前在茶叶种类、等级及产地判别上也有应用。Ning等[3]针对茶叶中儿茶素、咖啡碱及茶氨酸进行HPLC图谱分析，结合Fisher判定方法成功判定六大茶类；成浩[4-5]等采用HPLC建立绿茶化学指纹图谱，并结合逐步判别分析对扁形绿茶的原料品种及产品产地属性进行判定，正确率均较高。本研究选取龙井茶不同产区代表性样品，利用HPLC建立不同产区龙井茶样本的多元指纹图谱，采用3种化学计量学判别方法进行产地判别，以此优化基于HPLC指纹图谱的龙井茶产地判别方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验样本为2016年春季收集的来自3个产区25个取样点的龙井茶样品，共104个。其中西湖龙井茶样26份，分别来自西湖产区龙井村、翁家山、梅家坞等10个自然村的12个取样点；钱塘龙井茶样36份，分别来自钱塘产区3个县（淳安、富阳、萧山）的6个取样点；越州龙井茶样42份，分别来自越州产区3个县（新昌、嵊州、磐安）的7个取样点。

没食子酸（GA）、可可碱（TB）、茶叶碱（TP）、咖啡碱（CAF）、儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、杨梅素（Myr）、槲皮素（Que）、山奈素（Kae）、杨梅素-3-o-半乳糖苷（Myr-gla）、杨梅素-3-o-葡萄糖苷（Myr-glu）、杨梅素-3-o-鼠李糖苷（Myr-rha）、槲皮素-3-o-半乳糖苷（Que-gla）、槲皮素-3-o-葡萄糖苷（Que-glu）、槲皮素-3-o-芸香糖苷（Que-rut）、山奈酚-3-o-葡萄糖苷（Kaeglu）、山奈酚-3-o-芸香糖苷（Kae-rut）、牡荆素-2-o-鼠李糖苷（Vit-rha）等标准品，阿拉丁试剂公司；乙腈、乙酸、甲酸等试剂均为色谱纯级，Tedia公司。

1.2 样品处理

准确称取研磨至碎的茶样0.15 g，置于50 mL离心管内，加入50%乙醇25 mL，盖上离心管盖，置于70℃水浴锅内恒温加热30 min，每10 min缓慢摇动1次，取出冷却至室温，4℃和12 000 r/min条件下离心15 min，取上清液作为待测样品。

1.3 色谱分析方法

色谱条件1（儿茶素、生物碱组分的HPLC检测分析条件）[6]：色谱柱：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相 A：3%乙腈+0.5%乙酸+96.5%超纯水；流动相B：30%乙腈+0.5%乙酸+69.5%超纯水；流速1 mL/min，柱温25℃，进样量10 μL，检测波长280 nm。洗脱梯度：前40 min内B相由20%线性增加至75%，在40.01 min时降至20%B，接着以20%B相保持5 min。

色谱条件2（黄酮苷类的HPLC检测分析条件）[7-8]：色谱柱：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速1 mL/min，柱温35℃，进样量10 μL，检测波长360 nm。洗脱梯度：前40 min内B相由20%线性增加至40%，在40.01 min时降至20%B，接着以20%B相保持5 min。

1.4 数据处理

采用Excel 2010对HPLC指纹图谱数据进行预处理，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012A版）进行特征多元指纹图谱构建。采用SPSS 20.0软件进行判别因子分析（DFA）和多层感知器神经网络分析（MLP），采用MATLAB 2010软件进行支持向量机分析（SVM）。

2 结果与分析

2.1 三大产区龙井茶品质特征图谱的构建

采用已被验证并普遍应用于茶叶品质化学成分定量检测的HPLC检测方法，利用1.3节所述色谱条件1[6]能够同时检测出8种儿茶素、3种生物碱及没食子酸（图1），利用色谱条件2[7-8]能够同时检出12种黄酮及黄酮苷类化合物（图1），结果显示各色谱峰均呈现出良好的峰型及分离度。不同产区龙井茶样品经HPLC检测后采集图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对HPLC图谱进行叠加、参照图谱设置、多点校正、自动匹配等处理，生成对照图谱。采用平均数法得到不同产区龙井茶产品的特征图谱（图2）。由图2可看出，样品图谱中各色谱峰峰型及分离度均良好。基于样品图谱选择90%以上样本共有的具有标准峰型色谱峰为样本集共有峰，最终结合两种检测方法共选择28个色谱峰作为构建特征指纹图谱的特征峰。峰号如图2中标记所示，所选取的28个色谱峰峰面积占总峰面积90%以上，能够反映该检测条件下样品的品质组分情况。通过外标法与已知标准物质的HPLC图谱（图1）对比分析，其中16个色谱峰对应已知化合物，分别是：4号峰GA，5号峰 TB，6号峰 EGC、8 号峰 CAF，11 号峰 EC，12号峰 EGCG，13号峰 GCG，17号峰 ECG，19号峰Myr-gal，20 号峰 Myr-glu，21 号峰 Que-rut，22 号峰 Myr-rha，23 号峰 Que-gal，24 号峰 Que-glu，26号峰Kae-rut，28号峰Kae-glu；其它标记峰为未知化合物。

如图2所示，利用色谱条件1采集的指纹图谱干扰杂峰较少，基线平稳；采用色谱条件2采集的指纹图谱特征峰较为集中，基线略有起伏。干扰杂峰虽较多，但不影响特征峰识别及应用。三大产区龙井茶特征指纹图谱对比分析显示，指纹图谱中色谱峰响应值因产区不同而有所差异，28个特征峰中，1号、3号、8号、9号、12号、14号、17号峰在色谱条件1下较其它特征峰响应值相对较高，均大于500 000 mV；色谱条件2下的19～28号特征峰响应值相对于色谱条件1特征峰较低，响应值范围在1 000～25 000 mV之间，其中西湖产区及钱塘产区龙井茶特征指纹图谱中响应值大于10 000 mV的特征峰有21号及23号峰，而在越州产区龙井茶特征指纹图谱中信号响应值大于10 000 mV的特征峰除21号及23号峰外，还包括19号、20号及22号特征峰。此外，17号峰在西湖产区龙井茶特征指纹图谱中表现较明显，在其它两个产区龙井茶特征指纹图谱中响应相对较弱。由此可见，龙井茶不同品质成分在相同检测条件下因产区不同而表现出不同的信号响应值及组分间比例的差异，为指纹图谱应用于产区判别提供了可能。

图1 标准物质的HPLC-DAD检测图谱Fig.1 Standard-substances chromatograms based on HPLC-DAD detection

图2 三大产区龙井茶特征指纹图谱Fig.2 Characteristic HPLC-fingerprints for Longjing teas from three tea-producing areas

2.2 基于判别因子分析技术的龙井茶产区判别

基于2.1节中筛选出的28个特征峰，依据多元信息融合原则，将2个不同检测条件下的色谱数据以串行方式进行合并，确定其中一个样品中一个峰面积相对较大的主峰为参照峰，计算每个样品中每个特征峰的相对峰面积，以此进一步进行判别因子分析。判别因子分析（Discriminant factor analysis，DFA）是优化区分性的分类技术，用于识别和区分多组变量。本研究中将龙井茶样品按照法定产区来源分为3类，其中西湖龙井为1类（26个），钱塘龙井为2类（36个），越州龙井为3类（42个），采用选一留一法，将所有样本分为训练集52个和测试集52个。按Wilksλ法选择变量进行逐步判别分析并建立判别方程，再进行训练样本的回代判别，计算回代错判率。将每一样本逐一从训练集中去掉，再进行内部交叉验证分析，验证所建立方程的稳定性，最后采用外部验证样本验证判别方程的判别效果[5]。结果显示104个样本数据无缺失及越界，全部有效。经计算得到非标准化典型判别函数F1和F2，其中判别函数F1特征值为7.793，解释76.8%的方差；判别函数F2特征值为2.359，解释23.3%的方差，二者的典型相关系数均表现较高（F1为0.941，F2为0.838），表明判别函数F1和F2均能较好地体现类间差异。判别函数的Wilks’s Lambda检验显示F1与F2的Sig值均小于0.05，即两个判别函数均有统计学意义，判别有效。样品的联合分布显示（图3），三大产区质心函数分别为西湖龙井产区（4.534，-0.806），钱塘龙井产区（-2.567，-1.527），越州龙井产区（-0.607，1.808），不同产区间样本分离度较高，产区间区分显著。产区判别结果（表1）显示，在原有数据的所有龙井茶样品中，有96.2%的样品产区判断正确，其中1个西湖龙井样品误判为越州龙井；3个越州龙井样品误判为钱塘龙井；钱塘龙井所有样品产区判断正确率为100%。交叉验证的正确率为95.2%，其中有1个西湖龙井样品误判为越州龙井；4个越州龙井样品误判为钱塘龙井；钱塘龙井所有样品产区判断正确率为100%。由此可见，基于龙井茶HPLC指纹图谱，利用判别因子分析技术能够对样本产区进行较为准确的判别。

表1 龙井茶产区判别结果Table1 Geographic discrimination of Longjing teas

图3 不同产区龙井茶样本判别分析图Fig.3 Discriminant analysis of Longjing samples from three tea-producing areas

2.3 基于多层感知神经网络分析技术的龙井茶产区判别

多层感知器（Multilayer perceptron，MLP）是一种多层前馈神经网络，主要特点为信号向前传递，误差反向传递，根据预测误差调整网络权值和阈值，使输出的预测值不断接近期望输出。本研究以2.2节中构成多元指纹图谱的28个特征色谱峰的相对峰面积作为输入变量，以龙井茶的三大产区作为输出变量。将104个样品随机分为训练集（44个）、校验集（22 个）与测试集（38 个），运用 MLP神经网络方法进行分析。对HPLC产生的28个协变量数据进行统一标准化处理，作为网络输入层，输入层设定1个隐含层，隐含层个数为2，样品的产区作为网络输出层。采用Sigmoid作为输入层的激活函数，同时采用Softmax作为输出层的激活函数，并以共扼梯度法作为训练方法[9]进行产区分类预测。结果如表2所示，训练集、校验集及测试集产区预测总体正确率均在90%以上。不同产区中，钱塘产区龙井茶预测准确率最高，在训练集、校验集及测试集中预测准确率均达100%；西湖产区龙井茶在训练集中预测准确率为90.9%，11个样本中有1个样本误判为越州龙井，在校验集及测试集中预测准确率均达100%。越州产区龙井茶预测准确率相对较低，在训练集、校验集及测试集中预测准确率分别为94.1%，88.9%和81.3，其中训练集及校验集中样本误判为钱塘龙井，而在测试集中部分样品被误判为钱塘龙井，部分被误判为西湖龙井。上述结果表明，基于龙井茶HPLC指纹图谱，结合MLP神经网络技术能够较好地识别龙井茶样本的产区。

2.4 基于支持向量机分析技术的龙井茶产区判别

支持向量机（Support vector machine，SVM）分析技术是由Vapnik首先提出的。像多层感知器网络和径向基函数网络一样，支持向量机可用于模式分类和非线性回归，其主要思想是建立一个分类超平面作为决策曲面，使得正例和反例之间的隔离边缘被最大化，其理论基础是统计学习理论[10-11]。以2.2节中构成多元指纹图谱的28个特征色谱峰的相对峰面积作为输入变量，以龙井茶的三大产区（西湖产区标记为1，钱塘产区标记为2，越州产区标记为3）作为输出变量，将所有104个样本采用选一留一法，分为训练集（52个样本）和预测集（52个样本）。SVM参数采用遗传算法（Genetic algorithm，GA）进行优化。 结果（图4）显示：SVM 最佳参数 c、g分别为21.69和0.08，交叉验证正确率约为90.38%。实测集与预测集分类图（图5）显示52个预测样本中预测准确率达98.08%，有一个越州龙井错判为钱塘龙井。上述结果表明，基于龙井茶HPLC指纹图谱，结合SVM分析技术同样能够较好地识别龙井茶样本的产区。

表2 基于MLP法分类预测不同产区的龙井茶结果Table2 Geographical discrimination of Longjing teas based on MLP

图4 SVM最佳参数适应度曲线Fig.4 The best accuracy curve for SVM parameters

图5 产区预测检验分类图Fig.5 Predictive test of geographical discrimination

3 讨论与结论

龙井茶是采自地理标志产品保护范围内的茶树品种的鲜叶，按照传统工艺在地理标志产品保护范围内加工而成，具有“色绿、香郁、味醇、形美”的扁形绿茶。其中“西湖龙井”不仅具有极佳的品质，而且蕴藏着深厚的文化内涵，有着悠久的历史渊源，被历代文人雅士推崇赞颂，并自建国初期就被指定为“国宾礼仪之茶”。龙井茶产区地处钱塘江、曹娥江流域的山地丘陵，涉及浙江省18个县（市），总体自然环境表现为温暖多雨、空气湿润。研究显示成土母岩、土壤类型、性质及其元素全量和有效量直接影响龙井茶的质量[12]。杭州一带地质适中的黄泥沙土发育于泥盆纪石英岩，是适宜发展优质茶叶的土壤类型，有利于茶树生长及优良品质的形成。茶树品种是茶叶品质形成的物质基础，茶树品种的生长特性不仅决定了茶叶产量的高、低，也决定了其加工适制性及产品品质特征。依据国家标准GB/T 18650-2008《地理标志产品 龙井茶》规定，龙井茶茶树品种应选用龙井群体种、龙井 43、龙井长叶、迎霜、鸠坑种等经审（认）定的适宜加工龙井茶的茶树良种。而行业标准GH/T 1115-2015《西湖龙井茶》中定义“西湖龙井茶”是“以杭州市西湖风景名胜区和西湖区所辖区域内的龙井群体、龙井43、龙井长叶茶树品种的芽叶为原料采用传统的摊青、青锅、辉锅等工艺在当地加工而成的”。针对西湖产区3个茶树品种产品检测显示，其茶多酚总量及没食子酸含量较为接近，龙井43及龙井群体种氨基酸含量较龙井长叶高约0.5个百分点[13]。敖存等[14]针对钱塘产区龙井茶采用的主要茶树品种中茶108、龙井43、浙农117等11个品种进行感官品质及理化成分的比较分析，结果显示各无性系良种均较好地满足钱塘龙井茶的品质要求，其中安吉白茶、龙井长叶及鸠坑早等制得的产品具有品质优势。不同产区龙井茶在制作工艺上也有差别。传统西湖龙井茶的炒制技术全凭手工在一口表面光滑的炒锅中完成，采用“抖、搭、搨、捺、甩、抓、推、扣、压、磨”等技术，该技术称“十大手法”，分不同阶段不断变换炒制方法[15]，对制茶经验及理论掌握度要求较高。随着茶产业的不断发展壮大及制茶技术的不断进步，龙井茶制茶技术同样也经历了传承发展的过程，不同产区在传统制茶工艺基础上不断结合新技术进行演变[16]。目前龙井茶加工主要采用全手工炒制、全机械炒制和半机械半手工结合炒制3种制茶方式，三者制茶工艺流程基本一致，而成品茶品质风格不尽相同[17]。综上可见，产区的地球化学环境、茶树品种结构、制茶工艺等因素均可导致成品龙井茶品质的差异，而产区特征是上述因素的综合体现，这种特征差异体现在化学层面，即品质化学组分的差异。

本研究基于HPLC检测方法构建不同产区龙井茶多元指纹图谱，利用3种判定预测分析技术对龙井茶样本进行产区预测，结果显示判别因子分析法（DFA）、多层感知器法（MLP）、支持向量机法（SVM）的龙井茶产区预测准确率较高，分别为95.2%，92.1%，98.08%。3种判别技术显示产区错判率集中体现在越州产区龙井茶样本中，越州产区部分样本误判为钱塘龙井；极个别西湖龙井样本错判为越州龙井，在样本代表性有充分保障的前提下，推测是因训练集中同类样本比例较少的原因所致[4]。由此可认为，在代表样本库全面典型的前提下，基于HPLC多元指纹图谱结合化学计量法能够较好地对龙井茶样本进行产区预判。本研究结果为茶叶产地溯源及茶叶品质控制提供技术支撑。