安 磊 王 珂 孙雨辰 尹 航 张 维 黄小龙 王友升

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京工商大学 北京 100048）

图1 菊淀粉型果聚糖的结构（n=2～10或10～60）[2]Fig.1 Representation of the structure of insulin-type fructans（n=2-10 or 2-60）[2]

随着生活节奏的加快，人口老龄化日益加深，与衰老相关的认知功能障碍及相关的神经退行性疾病的发病率逐年提高[4]。大量实验和临床研究表明：应用饮食干预或营养补充剂在防治脑老化过程可能发挥重要作用[5-6]。脑老化的过程和机制比较复杂，目前研究认为对抗氧化应激和增强神经保护作用是防治脑老化的重要途径之一[7-8]。近年来，多项研究报道中药巴戟天中的菊淀粉型低聚果糖（与雪莲果中菊淀粉型低聚果糖具有类似的结构通式）具有改善认知和显著的神经保护作用[9-11]。最近作者在动物水平的研究中发现，雪莲果中菊淀粉型低聚果糖（Insulin-type oligosaccharides from yacon，YOs）可改善动物的认知功能及抑郁样行为[12-13]。鉴于此，本研究从体外抗氧化活性和细胞保护等方面探讨YOs的神经保护作用及其可能机制，为YOs进一步的开发和利用提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雪莲果，云南陆良种植基地。雪莲果去皮，烘干，打粉，加入去离子水，水和雪莲果粉（V/W）比例为20，90℃提取2 h，重复3次，旋蒸浓缩，加入乙醇进行醇沉24 h，收集上清，采用Sevage法去蛋白，大孔树脂柱层析法脱色得到粗提物，葡聚糖凝胶色谱（G20）纯化得到低聚果糖提取物。采用高效液相方法测定其中菊淀粉型果聚糖8～14个糖的总质量分数为69.72%[13]。YOs分子通式为：GF-Fn（G为葡萄糖，F为果糖，n=6～12），结构如图2所示。

图2 YOs的结构通式Fig.2 The structure of insulin-type oligosaccharides from yacon

1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基，东京化成工业有限公司；胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、RPMI 1640和DMEM/F12 培养液，美国Hyclone公司；青霉素、链霉素双抗和胰蛋白酶，美国Gibco公司；DMSO，美国Sigma公司；30%H2O2，北晨方正试剂厂；MTT检测试剂盒，北京普利莱基因技术有限公司；甲醇，北京化工厂。实验细胞为人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞，由军事医学科学院精神药理室张有志研究员惠赠。

1.2 主要仪器

超净工作台，北京昌平半导体设备仪器厂；CO2培养箱，美国RS Biotech公司；倒置相差显微镜，日本Olympus公司；电子天平，瑞士梅特勒公司；酶标仪，美国Perkin Elmer公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力测定[14]采用96孔板体系测定YOs对DPPH自由基清除能力，取0.177 g DPPH粉末溶于30 mL甲醇溶液中混匀，倍比稀释100倍得到0.15 mmol/L的DPPH溶液。在96孔板，取100 μL的不同质量浓度YOs（20，4，0.8，0.08 mg/mL）与 100 μL 0.15 mmol/L的DPPH或100 μL甲醇到孔中。在避光反应30 min后，用酶标仪测定515 nm波长下的吸光度值。按公式（1）计算抑制率。

式中，Ac——空白的吸光度（甲醇100 μL+DPPH 100 μL）；As——样品的吸光度（YOs 100 μL+DPPH 100 μL）；Ab——样品空白吸光度（YOs 100 μL+甲醇 100 μL）。

以水溶性维生素E（Trolox）为阳性对照。每组设3个复孔。由回归方程计算YOs对DPPH自由基抑制的IC50值，并以Trolox μmol/g YOs当量表示其相对抗氧化能力。

1.3.2 ABST自由基清除能力测定[15]同样采用96孔板体系测定YOs对ABTS自由基清除能力，将7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L过硫酸钾溶液按1∶1体积比混合，混合后的ABTS工作液室温避光放置12～16 h.使用前用PBS溶液（pH 7.4）调整ABTS工作液在734 nm 波长下的吸光度值达到（0.700±0.020），取 10 μL的不同质量浓度 YOs（20，4，0.8，0.08 mg/mL）与 200 μL 调整后的ABTS工作液于96孔板中，轻轻混匀，反应6 min后，用酶标仪测定734 nm波长处的吸光度值。每组设3个复孔，与DPPH试验中相同的抑制率公式计算ABTS抑制率，求得对ABTS自由基抑制的IC50值，并以Trolox μmol/g YOs当量表示其相对抗氧化能力。

1.3.3 YOs对Fe3+还原能力 参考文献[16]方法，通过 Fe3+还原试验（Ferric reducing antioxidant power，FRAP）评价 YOs的抗氧化活性。取 0.3 mol/L醋酸钠缓冲液，10 mmol/L TPTZ溶液，20 mmol/L氯化铁溶液按体积比10∶1∶1混合配制FRAP 工作液，取不同质量浓度 YOs（50～200 μg/mL）0.1 mL，与 3 mL FRAP工作液和0.3 mL双蒸水混匀，37℃水浴下反应10 min，于593 nm波长处测定吸光度值，每组设3个平行对照，同法用FeSO4标准溶液（0.1～0.8 mmol/L）绘制标准曲线，选择在标准曲线内的数值计算YOs还原能力，以FRAP 值表示。1 FRAP 单位=1 mmol/L FeSO4，即每克样品的抗氧化能力相当于FeSO4的mmol数值，mmol Fe+2/g。

（3）缺乏主管部门主持协调。各平台缺乏协调，各自为政，不能联合建设，项目多和全，建设重点不突出。致使学科基础、专业类实验项目大同小异，低层次重复建设现象严重，资源浪费。

1.3.4 H2O2致SH-SY5Y细胞损伤模型建立 SHSY5Y培养液为DMEM/F12培养基（10%FBS+青霉素 100 U/mL+链霉素 100 U/mL，pH 7.4）。取对数生长期的SH-SY5Y 细胞，以1×104/孔接种于96孔培养板中，待细胞融合度到70%～80%，弃去培养液，加入含有不同浓度 H2O2（100～600 μmol/L）培养液继续培养12 h或24 h，观察H2O2对SHSY5Y细胞活力的影响。每组设6个复孔，用MTT法检测吸光度值，并以对照组计算相对细胞活力。细胞活力计算公式：相对细胞活力=（OD处理-OD空白）/（OD对照-OD空白）×100%。

1.3.5 YOs对H2O2损伤SH-SY5Y细胞的影响取 对数生长期的SH-SY5Y细胞，以1×104/孔接种于96孔培养板中，待细胞融合度达到70%～80%，换入含有 YOs（0.1～1 mg/mL）的培养液培养 12 h，更换含有200 μmol/L H2O2的培养液继续培养12 h（参考1.3.4节的结果），用MTT法观察YOs对H2O2损伤SH-SY5Y细胞的保护作用。

1.4 数据统计与分析

数据结果以均值±标准差表示，数据应用软件GraphPad Prism 5.0版本分析，自由基清除试验采用非线性回归（Nonlinear regression）方程计算，细胞保护试验采用单因素方差分析（one-way ANOVA）Dunnett’s t-test检验进行多组间比较，P<0.05认为有显著性。

2 结果与分析

2.1 YOs的体外抗氧化能力

DPPH自由基是具有在波长517 nm处有特征吸收的稳定人工自由基，利用这一原理，DPPH自由基清除试验广泛用于各种样品的体外抗氧化活性评价。本研究中，YOs在0.8～20 mg/kg范围内，浓度依赖性的抑制DPPH自由基。不同质量浓度的YOs和阳性对照Trolox对DPPH自由基的抑制率见表1。由非线性回归方程计算YOs对DPPH自由基的IC50为（0.272±0.078）mg/mL，相当于（141.01±15.67）Trolox μmol/g YOs（见表3）。

与DPPH自由基类似，ABTS是另一种常用于抗氧化活性评价的人工合成自由基。ABTS试验显示，YOs对ABTS自由基的抑制作用弱于DPPH自由基，不同质量浓度的YOs和阳性对照Trolox对ABTS自由基的抑制率见表2。由非线性回归方程计算YOs对ABTS自由基的IC50为（2.67±0.89）mg/mL，相当于（195.81±8.13）Trolox μmol/g YOs（见表3）。

表1 YOs对DPPH自由基的抑制率Table1 The DPPH radical inhibition rate of YOs

表2 YOs对ABTS自由基的抑制率Table2 The ABTS radical inhibition rate of YOs

FRAP试验是利用抗氧化剂可以将Fe3+-TPTZ复合物氧化成Fe2+-TPTZ复合物，此过程伴随颜色变化的原理来评价抗氧化活性。FeSO4（0.1～0.8 mmol/L）标准曲线见图3，根据线性回归方程（y=0.7906x-0.0014，R2=0.9999）计算 YOs的FRAP值为（10.12± 0.35）mmol/g，相当于（82.40± 1.59）Trolox μmol/g YOs（见表3）。

2.2 H2O2对SH-SY5Y细胞活力的影响及YOs保护作用

SH-SY5Y细胞经过H2O2处理后胞体变圆，贴壁能力降低，数量减少。H2O2在100～600 μmol/L浓度范围内浓度依赖性降低SH-SY5Y细胞活力，见图4。其中200 μmol/L H2O2孵育12 h后，使细胞活力降低至对照组的74.82%，损伤强度适合药效学及药物机制的研究，与文献[17]报道一致。因此在进一步的细胞保护试验中采用此损伤条件制备H2O2损伤模型。

图3 FRAP试验中FeSO4标准曲线Fig.3 The standard curve of FeSO4in FRAP assay

细胞试验结果显示，YOs（0.1～1 mg/mL）可浓度依赖性的逆转H2O2（200 μmol/L）对SH-SY5Y的损伤，其中YOs在0.5，1 mg/mL质量浓度时对SH-SY5Y细胞的保护作用具有显著性（见图5），提示YOs对于SH-SY5Y细胞的氧化应激损伤具有神经保护作用。

表3 YOs的体外抗氧化活性Table3 Antioxidant activities of YOs

图4 H2O2对SH-SY5Y细胞的损伤作用Fig.4 Injured effect of different concentration H2O2 on SH-SY5Y cells

图5 YOs对H2O2所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用Fig.5 Cytoprotective effect of YOs on H2O2 treated SH-SY5Y cells

3 讨论

大脑衰老及相关神经退行性疾病病理机制复杂，至今不明，目前公认的始动因素为大脑衰老过程中，脑内氧化应激和脂质过氧化增加，引起炎症和纤维蛋白沉积。体内外研究均表明，多种天然抗氧化剂具有很好的防治脑老化作用，对抗氧化应激损伤可能是其发挥效应的重要机制之一[8]。

本研究通过DPPH，ABTS和FRAP中3个体外试验评价YOs的抗氧化活性，结果表明YOs具有较好的清除DPPH和ABTS自由基作用和Fe3+还原能力。SH-SY5Y细胞是一种分化程度较低的肿瘤细胞，其形态、生理和生化功能与正常神经细胞十分相近，被广泛应用于神经系统疾病发病机制和治疗药物筛选的研究。本试验采用H2O2损伤SH-SY5Y细胞模型，模拟高活氧状态的氧化应激损伤。 YOs（0.5，1 mg/mL）对这种损伤具有明显的逆转作用。综上，YOs对抗细胞氧化应激损伤作用与其体外抗氧化活性相一致。

近年来，研究表明肠道微生态可以通过神经途径、内分泌途径和免疫途径影响中枢神经系统功能，改善肠道微生态环境可以改善脑衰老过程及神经退行性疾病的脑代谢及行为[18]。前期研究发现YOs改善认知与抗抑郁样行为作用可能与其益生元作用有关[13]。本研究结果表明，YOs对H2O2所致的类神经细胞的氧化应激损伤具有明显的保护作用，这一作用可能与其典型的益生元作用相互促进，共同发挥防治脑老化及相关神经退行性疾病的作用。综上所述，雪莲果及其所含的菊淀粉性低聚果糖可能成为抗脑老化的明星食品及功能因子。