侯 靖 吕 布 崔恒林

（江苏大学食品与生物工程学院 江苏镇江 212013）

类胡萝卜素是一类应用广泛的黄色、橙红色或红色的脂溶性萜烯类色素，普遍存在于细菌、古菌、藻类、真菌和植物中[1]。迄今，被发现的天然类胡萝卜素已达750多种，其中大部分为由8个类异戊二烯单位组成的C40类胡萝卜素[1]。人类和大部分动物自身不能合成类胡萝卜素，必须从食物中获取。类胡萝卜素的长多烯碳链使其具有抗氧化作用，能够保护细胞免受氧化应激损伤，具有防癌、抗衰老、预防心血管疾病等生物活性功能[2]。作为着色剂和功能成分，类胡萝卜素已广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。采用微生物发酵生产天然类胡萝卜素不仅避免了化学合成法存在的安全性问题，而且克服了植物提取法受原料和季节限制的缺点，因而，微生物成为天然类胡萝卜素的主要来源[3-4]。

嗜盐古菌是一类通常生活在海水晒盐场、盐湖、腌制食品等高盐环境中的好氧或兼性厌氧、化能异养型原核微生物，在发酵工业中具有广泛应用前景[5]。大部分嗜盐古菌能够合成类胡萝卜素，呈现橙色或红色菌落。值得一提的是，很多嗜盐古菌合成的是C50类胡萝卜素，并非自然界常见的C40类胡萝卜素[6]。虽然嗜盐古菌合成类胡萝卜素早在20世纪60年代就有报道[7]，然而，相比于其它生物，对嗜盐古菌类胡萝卜素的研究却相对较少[8]，尤其是从未有过分离纯化嗜盐古菌类胡萝卜素粗提物的主要组分，并研究其生物活性的报道。嗜盐古菌成为有待进一步开发的产类胡萝卜素微生物资源。本研究以本实验室从美国犹他州大盐湖分离的解脂盐红菌（Halorubrum lipolyticum GSL-59）和我国浙江舟山盐田分离的海滨盐水红菌（Salinarubrum litoreum ZS-1-H）为研究对象，纯化并鉴定其类胡萝卜素主要组分，探究其抗氧化活性，为开发应用嗜盐古菌类胡萝卜素资源奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

解脂盐红菌GSL-59，本实验室分离保藏；海滨盐水红菌ZS-1-H，编号CGMCC 1.12544，本实验室分离，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；地中海富盐菌（Haloferax mediterranei ATCC 33500），中国普通微生物菌种保藏管理中心。

硅胶薄层层析板，德国默克公司；普通层析柱（内径15 mm，长度350 mm），泰兴市三爱思实验仪器厂；β-胡萝卜素，美国Sigma公司；酵母提取物、鱼蛋白胨，oxoid试剂公司；其它试剂，国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯级。

NHM 培养基成分（g/L）：酵母提取物 0.05，鱼蛋白胨 0.25，丙酮酸钠 1.0，KCl 5.4，CaCl20.29，NH4Cl 0.27，MgSO4·7H2O 26.8，MgCl2·6H2O 23.0，NaCl 184.0，K2HPO40.3，pH 7.0～7.2。

1.2 设备与仪器

超净工作台，苏州净化设备有限公司；LRH-250生化培养箱，上海一恒科技有限公司；全自动灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司；HH-S2数显恒温水浴锅，江苏省金坛市医疗仪器厂；Avanti J-14离心机，Beckman公司；HYG-C型多功能摇床，太仓实验设备厂；RE-2000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；pHS-3TC型酸度计，上海天达仪器有限公司；B040234全自动酶标仪，芬兰Thermo公司；DU800TM核酸蛋白分析仪，Beckman-Coulter公司；LXQ型液相色谱离子阱质谱联用仪，Thermo公司。

1.3 试验方法

1.3.1 类胡萝卜素的提取和定量 参考Fang等[9]的方法于暗处提取类胡萝卜素。解脂盐红菌、海滨盐水红菌和地中海富盐菌经NHM液体培养基活化后，以2%的比例接种于500 mL NHM培养基中，37℃，130 r/min培养至稳定期。将菌液于4℃，10 000×g离心15 min，收集菌体，用灭菌的10%NaCl溶液悬洗3遍后，加入50 mL丙酮于摇床振荡提取 30 min。4℃，10 000×g离心 15 min，收集上清液，残渣继续用丙酮提取至颜色灰白。合并上清，旋转蒸发至干，用少许甲醇溶解残留物，于-20℃避光保存。

1.3.2 类胡萝卜素的紫外-可见吸收光谱（UVVis）分析对类胡萝卜素溶液在350～600 nm范围内进行波长扫描，记录吸收光谱。

1.3.3 类胡萝卜素的薄层层析（TLC）分析 将3株嗜盐古菌的类胡萝卜素溶液点样于TLC板，晾干后将TLC板置于盛有展开剂为丙酮∶正庚烷=50∶50（V∶V）的层析缸内展开[9]。待展开剂前沿离顶端约0.5 cm时，取出TLC板，晾干，扫描、拍照。

1.3.4 硅胶柱层析法纯化类胡萝卜素粗提物 称取10 g硅胶（120℃，活化2 h）溶解于正庚烷/丙酮（80∶20，V∶V）中，湿法装柱。将类胡萝卜素粗提物上样，用正庚烷/丙酮混合溶剂梯度逐级洗脱，经70∶30，60∶40，50∶50（V∶V）比例的正庚烷/丙酮分别洗脱各红色条带。收集的洗脱液旋转蒸发至干后，用少量甲醇溶解。

1.3.5 液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）分析色谱条件：Shim-pack VP-ODS C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），检测波长 493 nm，流速 0.9 mL/min，进样量20 μL，柱温30℃。流动相：A：100%甲醇；B：100%异丙醇。 洗脱条件：0～5 min，100% ～98% A；5 ～35 min，98% ～95% A；35 ～40 min，100%A。

质谱条件：大气压力化学电离源（APCI），扫描范围m/z 100～1200，正离子监测模式；蒸发温度400℃，透镜电压120 V，毛细管电压40 V，毛细管温度250℃。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的测定 利用酶标仪测定DPPH自由基的清除率。将40 μL类胡萝卜素溶液（4.0 μg/mL，8.0 μg/mL，12.0 μg/mL）和140 μL 0.5 mmol/L DPPH溶液（甲醇配制）混匀，于暗处静置30 min，测量反应液在517 nm处的吸光度 Ai。同时测量 Ac：140 μL 0.5 mmol/L DPPH溶液和40 μL 甲醇的混合液的吸光度，Aj：40 μL类胡萝卜素溶液和140 μL甲醇的混合液的吸光度。 清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]× 100%。 设置 3组平行试验。

1.3.7 羟基自由基清除能力的测定 采用酶标仪测定羟基自由基的清除率。将50 μL 4 mmol/L FeSO4溶液，50 μL 4 mmol/L H2O2溶液和50 μL类胡萝卜素溶液（4.0 μg/mL，8.0 μg/mL，12.0 μg/mL）混匀，静置 10 min，加入 50 μL 4 mmol/L 水杨酸溶液（乙醇配制），混匀，静置30 min后于510 nm处测量吸光值Ai。同时测量Ac：甲醇代替类胡萝卜素溶液的吸光度；Aj：乙醇代替水杨酸溶液的吸光度。清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]× 100%。设置3组平行试验。

1.4 数据分析

数据测定3次，以“平均值±标准差”表示，用SPSS 18.0进行显著性分析，显著水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 类胡萝卜素粗提物的UV-Vis分析

如图1所示，解脂盐红菌的类胡萝卜素粗提物在464，494 nm和525 nm处有明显的吸收峰，海滨盐水红菌的类胡萝卜素粗提物在465，493 nm和524 nm处有明显的吸收峰。另外，在约367 nm和384 nm处均有两个顺式异构体吸收峰。两株嗜盐古菌类胡萝卜素的紫外-可见吸收光谱呈现C50类胡萝卜素菌红素及其衍生物特有的三指峰光谱[10]，提示其主要组分为菌红素及其衍生物。

图1 两株嗜盐古菌类胡萝卜素粗提物的UV-vis光谱Fig.1 UV-vis absorption spectra of the carotenoids from two haloarchaeal strains

2.2 类胡萝卜素粗提物的TLC分析

以地中海富盐菌的类胡萝卜素粗提物作为TLC分析的参照样，其3个红色条带已被确定为菌红素、单脱水菌红素和双脱水菌红素[9]。从图2可看出，解脂盐红菌和海滨盐水红菌的类胡萝卜素粗提物在对应的位置同样存在3个红色条带，表明解脂盐红菌和海滨盐水红菌中可能也存在菌红素、单脱水菌红素和双脱水菌红素，并且菌红素是最主要组分。

图2 解脂盐红菌（1）、海滨盐水红菌（2）、地中海富盐菌（3）类胡萝卜素粗提物的TLC图谱Fig.2 TLC analysis of the carotenoids from Hrr.lipolyticum（1），Srr.litoreum（2）and Hfx.mediterranei（3）

2.3 解脂盐红菌类胡萝卜素主要组分的鉴定及含量分析

解脂盐红菌类胡萝卜素粗提物经硅胶柱层析纯化，获得3个红色组分R1、R2和R3。如图3和表1所示，R1组分的HPLC图谱上主要有4个峰，质谱结果表明其相对分子质量为740，推断为菌红素。R2组分的HPLC图谱上主要有5个峰，除峰2外，其它4个峰的相对分子质量为722，推断为单脱水菌红素。峰2需在后续研究中进一步鉴定。R3组分的HPLC图谱上主要有3个峰，其相对分子质量为704，推断为双脱水菌红素。碎片离子符合已报道的菌红素、单脱水菌红素和双脱水菌红素的断裂模式[11]，如丢失水分子（-18）、C4H10（-58）和C8H10（-106）等。 每个组分中不同保留时间的峰可能是不同的顺、反异构体[11]。R1、R2和R3分别为菌红素、单脱水菌红素和双脱水菌红素。如图3和表2所示，根据相近保留时间，推断粗提物的HPLC图谱上峰1～4为菌红素，峰5～7为单脱水菌红素，峰8～10为双脱水菌红素。基于峰面积比，可得解脂盐红菌类胡萝卜素中菌红素含量为84.91%，单脱水菌红素含量为7.87%，双脱水菌红素含量为4.03%。

图3 解脂盐红菌类胡萝卜素主要组分及粗提物的HPLC图谱Fig.3 HPLC elution profiles of the purified carotenoid components and crude carotenoid extract from Hrr.lipolyticum

表1 解脂盐红菌类胡萝卜素主要组分的HPLC-MS/MS分析Table1 HPLC-MS/MS analysis of the purified carotenoid components from Hrr.lipolyticum

表2 解脂盐红菌类胡萝卜素主要组分的含量分析Table2 Content of the purified carotenoid components from Hrr.lipolyticum

图4 海滨盐水红菌类胡萝卜素主要组分及粗提物的HPLC图谱Fig.4 HPLC elution profiles of the purified carotenoid components and crude carotenoid extract from Srr.litoreum

2.4 海滨盐水红菌类胡萝卜素主要组分的鉴定及含量分析

海滨盐水红菌类胡萝卜素粗提物经硅胶柱层析纯化，得到2个红色组分R1和R2。如图4和表3所示，R1组分的HPLC图谱上主要有4个峰，其相对分子质量为740，推断为菌红素。R2组分的HPLC图谱上主要有5个峰，除峰2外，其它4个峰的相对分子质量为722，推断为单脱水菌红素。峰2需在后续研究中进一步鉴定。碎片离子符合已报道的菌红素和单脱水菌红素的断裂模式，每个组分中不同保留时间的峰可能是不同的顺、反异构体[11]。R1和R2分别为菌红素和单脱水菌红素。同样地，如图4和表4所示，根据相近保留时间，推断粗提物的HPLC图谱上峰1～4为菌红素，峰5～7为单脱水菌红素。基于峰面积比，可得海滨盐水红菌类胡萝卜素中菌红素含量为94.86%，单脱水菌红素含量为1.17%。双脱水菌红素可能由于含量很低，因此未纯化得到。

2.5 DPPH自由基清除能力

从解脂盐红菌类胡萝卜素粗提物中纯化得到各组分的DPPH自由基清除能力如图5所示。菌红素、单脱水菌红素和双脱水菌红素组分的DPPH自由基清除能力虽无显著差异（P＞0.05），但均显著高于β-胡萝卜素（P＜0.05）。从海滨盐水红菌类胡萝卜素粗提物中纯化得到的各组分的DPPH自由基清除能力如图6所示。同样，菌红素和单脱水菌红素组分的DPPH自由基清除能力虽无显著差异（P＞0.05），但均显著高于β-胡萝卜素（P＜0.05）。DPPH自由基清除能力均呈浓度依赖性，随着浓度升高，清除能力明显增强。

2.6 羟基自由基清除能力

从解脂盐红菌类胡萝卜素粗提物中纯化得到的各组分的羟基自由基清除能力如图7所示。菌红素、单脱水菌红素和双脱水菌红素组分的羟基自由基清除能力虽无显著差异（P＞0.05），但均显著高于β-胡萝卜素（P＜0.05）。从海滨盐水红菌类胡萝卜素粗提物中纯化得到的各组分的羟基自由基清除能力如图8所示。菌红素和单脱水菌红素组分的羟基自由基清除能力虽无显著差异（P＞0.05），但均显著高于 β-胡萝卜素（P＜0.05）。羟基自由基清除能力均呈浓度依赖性，随着浓度升高，清除能力明显增强。

表3 海滨盐水红菌类胡萝卜素主要组分的HPLC-MS/MS分析Table3 HPLC-MS/MS analysis of the purified carotenoid components from Srr.litoreum

表4 海滨盐水红菌类胡萝卜素主要组分的含量分析Table4 Content of the purified carotenoid components from Srr.litoreum

图5 解脂盐红菌类胡萝卜素各组分DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging activities of the purified carotenoid components from Hrr.lipolyticum

图6 海滨盐水红菌类胡萝卜素各组分DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activities of the purified carotenoid components from Srr.litoreum

图7 解脂盐红菌类胡萝卜素各组分羟基自由基清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activities of the purified carotenoid components from Hrr.lipolyticum

图8 海滨盐水红菌类胡萝卜素各组分羟基自由基清除能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activities of the purified carotenoid components from Srr.litoreum

解脂盐红菌3个纯化的组分在检测浓度范围内DPPH自由基清除率在23%～40%，羟基自由基清除率24%～44%；海滨盐水红菌两个纯化的组分在检测浓度范围内DPPH自由基清除率在18%～31%，羟基自由基清除率约28%～52%。两个菌株纯化的组分清除DPPH和羟基自由基的能力存在一定差异，可能是因存在不同比例的顺、反式异构体。总的来说，菌红素、单脱水菌红素或双脱水菌红素组分的自由基清除能力均显著高于β-胡萝卜素，提示较高的抗氧化活性，这可能是由于类胡萝卜素抗氧化活性与其分子中含有的共轭双键的数目有密切的关系[12]。菌红素、单脱水菌红素和双脱水菌红素存在13个共轭双键，而β-胡萝卜素仅有11个共轭双键，因而，C50类胡萝卜素菌红素及其衍生物在抗氧化活性方面具有重要的应用价值。

3 结论

1）采用紫外-可见光谱法、薄层层析和高效液相色谱-质谱联用技术对两株嗜盐古菌所产类胡萝卜素进行组分鉴定及含量分析，结果表明：解脂盐红菌的类胡萝卜素中菌红素占84.91%，单脱水菌红素7.87%，双脱水菌红素4.03%；海滨盐水红菌的类胡萝卜素中菌红素占94.86%，单脱水菌红素1.17%。

2）通过硅胶柱层析纯化类胡萝卜素粗提物中的主要组分，通过测定DPPH和羟基自由基清除能力评价其抗氧化活性，结果表明：解脂盐红菌和海滨盐水红菌的菌红素、单脱水菌红素或双脱水菌红素组分的DPPH和羟基自由基清除能力均呈浓度依赖性，并且均显著高于β-胡萝卜素，提示具有较强的抗氧化活性。