顾 双 王向阳

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州 310018）

果蔬保鲜的关键是既要维持生命，又要抑制自身代谢和阻止腐败菌侵染。适当的胁迫如低温、高温和紫外等处理有助于激发果蔬的抗逆生理，抑制自身旺盛代谢，提高抗病性[1-3]。低温冷藏是有效采后控制果蔬品质的常见手段[4]，然而外界胁迫条件超过果蔬所能承受的临界值时，果蔬遭受冷害。找到果蔬合适的低温承受临界点，能有效延缓果蔬的衰老腐烂并减少冷害的发生。赵志磊等[5]报道0℃冷激处理芒果3，4 h和5 h，均显著降低果实在2℃贮藏期间的冷害指数和冷害率，提高ATP酶、细胞色素氧化酶和过氧化物酶（POD）的活性。陈留勇等[6]将采后黄桃用0℃的冰水浸泡30 min，然后0℃下贮藏，抑制了其呼吸强度，降低聚半乳糖醛酸酶（PG）活性、丙二醛（MDA）含量和电解质渗出率。庞凌云等[7]将圣女果用0℃的冰水处理0.5～2.0 h，并于8℃下贮藏，有效降低了其呼吸速率及可溶性固形物含量，减缓了POD活性的升高，延缓了果实的成熟衰老。对于冷害的研究，解静[8]将番茄先在3℃下冷藏两周，再置于20℃下贮藏16 d，定期检测一系列指标，来明确1-甲基环丙烯（1-MCP）对番茄冷害的作用。张昭其等[9]对低温贮藏中的芒果进行间歇升温处理，延迟了2℃贮藏果冷害引起的乙烯释放及呼吸强度，抑制细胞膜透性增加，提高了芒果的抗冷害能力。这些果蔬及香蕉、青椒等在稍低于冷害温度贮藏时，需要15～45 d才能出现冷害症状。也有一些果蔬，如桃子、芦笋等在0℃下长期贮藏，也常常发生冷害。一些蔬菜，如青菜等的冷藏低限温度和是否有冷害至今不清楚，如果通过贮藏效果的试验来确定冷激温度和冷藏温度，其实验周期太长，也容易错过季节，因此亟需一种快速评估果蔬承受临界低温的方法。

果蔬细胞中的各类细胞器功能正常，其生命才有保证，叶绿体是蔬菜产生自由基最多的细胞器，也是衰老过程中最早衰退的细胞器之一。各种色素在膜上规则排列，具有吸收光能和释放荧光的特性，如果叶绿体的类囊体膜或光合中心受到损伤，荧光就会出现变化[10]。检测其功能是否正常，基本可以代表细胞内细胞器的活力状态和膜是否正常，通过叶绿素荧光测定仪能够对这方面提供一种快速、无损的检测方法。姚春娟等[11]研究发现不同决明属植物草决明、望江南和伞房决明的叶绿素荧光特性差异较大，主要是F0、Fm、Fv/Fm、ETR指标的差异。Saeid等[12]报道光强和水分胁迫降低了芦荟的Fm，Fv/Fm，YII、叶绿素含量和qP，而增加了NPQ，F0和花色苷含量。作者设想应用叶绿素荧光参数来确定蔬菜不同低温处理的差异。

蔬菜衰老劣变过程中，促进了膜脂质的过氧化，膜的完整性受到破坏，表现出膜的透性增大和离子渗漏[13]。目前采用测定电导率来表示离子渗漏和膜透性情况[14-16]，其依据是离子从细胞内渗漏。作者前期试验发现，离子选择性电极比电导仪能更灵敏地测定离子渗漏情况，也有一些人报道过此方法。Harker等[17]采用钙离子选择电极测定了苹果细胞内、外的钙离子含量。David等[18]利用钙离子选择电极测定了苹果果实中的钙含量，发现此方法可用来检测果实中低钙的临界水平。戴自飲等[19]用氯离子选择性电极测量了生菜、菠菜等27种果蔬中的氯离子含量，与化学测量氯离子含量方法相比，结果基本一致，避免了化学测定氯离子使用汞试剂，使实验人员更加安全，并减少环境污染。使用离子选择电极法测定蔬菜中的离子溶出浓度并不多见。作者前期试验筛选出钾、钙、钠3种离子选择性电极对测定离子溶出有较高的敏感性。本试验以青菜（Brassica rapa var chinensis）作为代表，使用这些离子的检测电极配合叶绿素荧光测定，可快速确定青菜低温贮藏的临界点温度，为未来蔬菜冷激处理或冷藏温度的快速确定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青菜品种为“上海青”，当地清晨采收，立即运回实验室。青菜从外向内数第1，2片叶子为外叶，试验用外叶。

1.2 仪器与设备

基础型叶绿素荧光仪（Junior-Pam型），德国Walz公司；电子天平（AY-120），日本 Shimadzu 公司；自动滴定仪（ZDJ-5型）、钾离子电极（PK-1-01型）、钙离子电极（PCa-1-01型）、钠离子电极（6801-01 型）、甘汞参比电极（217 型、232-01 型和6802-01型），上海仪电科学仪器股份有限公司；密封式恒温可调电加热器（FD-2型），嘉兴市欣欣仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 冷却处理的临界温度试验 取10组青菜叶片，每组3张，用250 mL烧杯放入200 mL提前冰冻的盐水，插入温度计，当温度达-6℃时将1组叶片放入盐水（0℃以下为食盐水，0℃以上为去离子水）中，低温浸泡1 min后取出，用吸水纸吸干水分。 在温度分别为-4，-2，-1，0，2，4，6，8 ℃和10℃ 时重复以上操作。根据试验结果筛选，另取7 组叶片，选择-6，-4，-2，0，1，2℃和4 ℃处理叶片10 min。另取4组叶片，选择0，1，2和4℃处理叶片30 min。随时观察温度，添加盐冰维持温度稳定。每次样品处理后分别测定叶绿素荧光参数。

1.3.2 钾、钠、钙离子的溶出测定 将青菜叶片去梗，剪成细长条状，称取1.0 g（1份样品）放在玻璃培养皿中，测定经0，1，2，3℃和4℃处理的青菜叶片30 min后 K+、Ca2+和Na+的浓度变化。测定K+、Ca2+和Na+前，均加入 0.05 mL离子调节剂。 测定Na+前用0.2 mol/L二异丙胺将溶液pH值调至10，以消除H+对电极的干扰。试验测定重复3次，取平均值。

1.4 测定方法

1.4.1 叶绿素荧光参数的测定和分析[20-22]以上不同温度处理的青菜叶片均过30 min暗反应后，每叶取左、中、右 3个部位，打开内源光化光（1 150 μmol/m2/s），至稳态后照射远红外光，测定各种参数并分析。

参数说明：F0——最小荧光（Minimuml fluorescence level）；Fm——最大荧光（Maximum fluorescence level）；Fv/Fm——可变荧光（Maximum photochemical quantum yield ofPS II）；Y（II）——实际量子产量（Effective photochemical quantum yield of PS II）；ETR——表观电子传递速率（The rate of relative electron transport），μmol/m2·s；qP——光化学猝灭系数（Coefficient of photochemical fluorescence quenching）；qN（Coefficient of non-photochemicall fluorescence quenching）、NPQ——非光化学猝灭系数（Non-photochemical fluorescence quenching）；Y（NO）——非调节性能量耗散的量子产量（Quantum yield of non-light induced）。

1.4.2 标准曲线的绘制 分别用 KCl、CaCl2、NaCl标准溶液配成 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5mol/L浓度梯度，由稀到浓分别测试离子电极电位。根据电位值（mV）和离子浓度的负对数值（-lg（c（X）））绘制电极的标准曲线，结果见图1。

1.4.3 钾、钠、钙离子溶出的测定 在测量杯中放入50 mL去离子水，取0，1，2，4℃处理的青菜样品各1.0 g放入杯中，转子速度为60 r/min，测定样品1 h内K+、Ca2+和Na+溶出电位，每隔20 s读数记录，通过标准曲线换算得到离子溶出量，计算公式如下：

图1 K+ （a）、Ca2+ （b）、Na+ （c）标准曲线Fig.1 Standard curves of K+ （a）、Ca2+ （b）and Na+ （c）

式中，X——电位对应标准曲线上的浓度负对数值；M——摩尔质量，g/mol；V——溶液体积，mL；m——样品量，g。

1.5 数据分析

采用SPSS 13.0软件对各组变量值进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 冷水处理对青菜叶绿素荧光参数的影响

青菜叶片冷水处理1 min，当温度低至-4℃时，ETR、qP、NPQ和qN 都显著下降（P<0.05），Y（NO）显著上升（P<0.05）；NPQ和qN 在-2℃时，均出现小幅度上升，有较弱的冷激反应；当温度低至-6 ℃时，Fv/Fm、Y（II）、F0显著下降（P<0.05）。 青菜低于冰点贮藏，会受到伤害。1 min冷水处理，在-4℃时检出显著差异，显然处理时间1 min是不够的。

青菜叶片冷水处理10 min，在0℃时，除F0外所有参数都出现显著差异（P<0.05），其中ETR和qP下降极显著（P<0.01），提示青菜在0℃下长期贮藏可能有冷害。1℃处理的NPQ和qN稍微高于2℃处理，显示稍有冷激反应，然而和其它指标一样都没有显著差异。与4℃相比，所有参数在2℃时均无异常变化，说明2℃下贮藏是安全的。0℃冷水处理10 min已能检出低温伤害，其中ETR和qP是最灵敏的指标。

处理30 min时，多数荧光参数的变化规律与处理10 min类似。2℃处理的NPQ和qN显著高于其它温度（P<0.05），ETR、Y（II）显著降低（P<0.05）。F0之间没有显著性差异。青菜低温处理30 min才有显著的冷激反应，2℃能引起冷激反应，见图2。

图2 冷（或盐）水处理对青菜叶片荧光参数的影响Fig.2 Effect of cold（or salt）water treatment on chlorophyll fluorescence parameters of pak choy leaves

2.2 冷水处理对青菜钾、钠、钙离子溶出的影响

Ca2+主要存在于细胞壁，多以结合态存在，细胞内游离钙的浓度很低[23]。0，1，2℃处理青菜30 min后Ca2+的溶出显著高于3，4℃处理。比4℃处理分别高68%，76%和86%。一般温度高，溶出速度快，然而低于2℃处理反而溶出更多，说明2℃以下低温可能影响细胞壁其它物质与Ca2+的结合状态。

K+主要存在于细胞内部，呈游离态，其溶出需要通过细胞膜，测定其溶出速度有利于分析细胞膜阻隔性。在0～4℃范围，温度越低青菜K+溶出越多。1℃处理青菜溶出显著高于4℃处理（P<0.05），1～3℃处理之间没有显著差异。0℃处理青菜的K+溶出量极显著高于其它低温处理（P<0.01），比4℃处理高26.2%，说明此时细胞膜对K+的阻隔显著下降。0℃下长期贮藏对青菜有明显伤害，1℃处理对细胞有轻微的影响。

Na+细胞外浓度高于细胞内，呈游离态。细胞内体积空间大，Na+含量也较多。在0～4℃范围，温度越低青菜Na+溶出越少，这与大量Na+离子在细胞外，低温抑制溶出有关。1℃和2℃处理青菜的Na+溶出显著低于 3℃和4℃处理（P<0.05），0℃处理显著低于 1℃和2℃处理（P<0.05）。 0，1，2℃处理青菜Na+溶出分别比4℃处理低79.8%、30.6%和22.2%，如图3所示。

图3 低温处理对青菜 Ca2+ （a）、K+ （b）和Na+ （c）扩散和溶出量的影响Fig.3 The effect of low temperature treatment on osmosis and diffusion amounts of Ca2+ （a），K+ （b）and Na+ （c）from pak choys leaves

3 结论

冷盐水处理1 min不足以影响叶绿素荧光参数来判断青菜冷害、冷激温度和时间、安全温度。冷水处理10 min，可以判断冷害温度，其中ETR和qP最灵敏。青菜在0℃下长期贮藏可能有冷害，而10 min低温处理还不足以激发显著的冷激反应。冷水处理30 min，同样可以判断0℃有冷害。ETR和YII作为检测指标最灵敏，2℃处理30 min能诱发显著的冷激反应，有助于判断冷激温度和时间。ETR对低温反应很灵敏，可以作为低温伤害的初期指标，Fv/Fm可作为实际伤害指标。NPQ和qN的上升可作为逆境指标。

冷处理后K+溶出作为细胞膜透性评价指标比较科学，0℃处理30 min后K+溶出极显著上升，说明青菜在0℃下贮藏可能有冷害。0～2℃处理Ca2+溶出显著上升，说明已引起细胞壁的变化。

汇总低温对青菜叶绿素荧光和离子溶出的参数，冷处理10 min以上可判断冷害温度。青菜在0℃下长期贮藏有冷害；2℃有冷激反应，也可以安全贮藏。诱发冷激反应的时间为30 min。