芦 宇 吕长鑫* 焦天慧 常 俏 纪秀凤 孙 彤 王维民 王贵虹 励建荣

（1 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁省食品安全重点实验室生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州 121013

2 大连中超食品有限公司 辽宁大连 116400

3 辽宁新大地实业发展集团有限公司 辽宁沈阳 110168）

红树莓又称覆盆子、托盘等，果实营养丰富，有“生命之果”的美誉[1-2]。随着红树莓产业发展，红树莓果汁、果酒、酸奶等系列产品相继问世，然而，在加工过程中产生大量的副产物--红树莓籽常被丢弃，未得到有效的开发利用。红树莓籽中含有大量的黄酮类化合物、鞣花酸、花色苷等[3]。其中黄酮类化合物具有降血压，抗氧化，抗癌，抗肿瘤等功效[4-5]。采用聚酰胺树脂纯化黄酮类化合物，二者通过结合形成氢键，从而使黄酮与不能形成氢键的组分分离，达到提纯的目的[6-7]。此方法不仅成本低，效率高，稳定性好，而且树脂可再生，适于工业化制备[8-10]。

随着人们生活方式和饮食结构的变化，我国高血脂的发病率逐年升高。高血脂症是引发心脑血管疾病的主要原因之一[11]。目前常见的降血脂药物多为化学合成，不仅价格昂贵而且会引发一系列毒副作用，因此开发天然降血脂药物将成为研究热点。胆固醇降解会产生胆汁酸盐，黄酮类化合物能够与胆酸盐结合，降低胆汁酸的重吸收率，促进肝脏或血液中的胆固醇降解，生成更多胆酸盐，从而降低血液中胆固醇含量[12-14]。本研究以红树莓籽为原料，采用大孔树脂-聚酰胺联用法纯化红树莓籽黄酮，研究其纯化工艺以及降血脂能力，以期得到高纯度的红树莓籽黄酮，为开发天然降血脂药物提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

红树莓籽，红树莓果渣中分离。

AB-8大孔树脂，天津市光复精细化工研究所；聚酰胺（30～60 目），勤实科技；牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸钠，美国Sigma公司；亚硝酸钠、柠檬酸、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、硫酸均为分析纯级，天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 设备与仪器

ALPHA1-2 LD plus冷冻干燥机，北京奥创兴业有限公司；UV2700紫外分光光度计，日本岛津公司；PL303电子天平、FE20 pH计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；RE-52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；XZ-1水循环真空泵，上海西利嘉真空设备制造有限公司。

1.3 预处理

1.3.1 红树莓籽粉制备 将红树莓籽经真空冷冻干燥24 h，在1 200 r/min条件下研磨 2 min，过60目筛制得红树莓籽粉，待用。

1.3.2 树脂预处理与再生 参照冯爱娟等[15]的研究方法处理大孔树脂，45℃烘干备用，树脂再生方法同预处理。将聚酰胺置于95%乙醇中浸泡24 h，充分溶胀后用去离子水冲洗至流出液不再呈白色浑浊，再经10%醋酸浸泡12 h，蒸馏水洗至中性，再经5 mg/mL氢氧化钠溶液浸泡12 h，蒸馏水洗至中性，45℃烘干，置于干燥器中备用[16]。

1.3.3 红树莓籽粗黄酮粉制备 称取一定量1.3.1节中红树莓籽粉以料液比1∶10 g/mL加入石油醚，在40℃下浸泡4 h，抽滤后取粉，按1∶30 g/mL加入80%乙醇，在50℃下水浴提取2 h，所得提取液旋转蒸发至膏状，并置于真空冷冻干燥机中干燥24 h，制得红树莓籽粗黄酮粉，备用。

1.3.4 红树莓籽黄酮浓度测定方法 以芦丁为标准品，采用硝酸铝法测定样品黄酮浓度。配制0.1 mg/mL 标液，分别吸取 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于25 mL容量瓶中，分别加入0.75 mL质量分数5 mg/mL的亚硝酸钠溶液，混匀静置6 min后，加入0.75 mL质量分数10 mg/mL硝酸铝溶液，混匀静置6 min再向其中加入10 mL质量分数4 mg/mL氢氧化钠溶液，定容混匀后静置15 min[17]。用紫外分光光度计在波长510 nm处测定吸光值，绘制标准曲线，得到回归方程。根据回归方程计算黄酮浓度。

1.4 AB-8大孔树脂初纯化红树莓籽黄酮

取20 g的AB-8树脂湿法上柱，将1.3.3节中粗黄酮粉溶解成12 mg/mL黄酮水溶液100 mL，调节pH值至4.5，以1.5 mL/min流速上样，树脂吸附饱和后用蒸馏水洗至流出液呈无色，用150 mL的60%乙醇以1.5 mL/min流速洗脱，将洗脱液旋转蒸发至膏状，置于真空冷冻干燥机中干燥24 h，取粉备用。

1.5 聚酰胺树脂二次纯化红树莓籽黄酮

1.5.1 泄漏曲线绘制 取1.3.2节中10 g聚酰胺树脂湿法上柱，称取1.4节中黄酮干粉用水溶解制成5.5 mg/mL的样液150 mL，调节pH值为4.5，上样流速为1.5 mL/min，在此条件下上样，流出液每10 mL收集1管，测定黄酮浓度，当流出液浓度为初始的1/10时视作泄漏[18]，绘制泄漏曲线。

1.5.2 红树莓籽黄酮吸附条件确定 取100 mL黄酮质量浓度为5.5 mg/mL样液上样，样液pH值分别为3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，流速分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL/min上样，收集流出液并弃去前10 mL液体，测定流出液中黄酮浓度，计算吸附率。按公式（1）计算吸附率[19]。

式中，C0——上样液中黄酮质量浓度（mg/mL）；V0——上样液体积（mL）；C1——流出液中黄酮质量浓度（mg/mL）；V1——流出液体积（mL）。

1.5.3 洗脱曲线绘制 以1.5.2节中最佳条件上样，树脂吸附饱和后，用蒸馏水洗至流出液呈无色，再取160 mL的60%乙醇，以1.5 mL/min的条件洗脱，流出液每10 mL收集1管，测定黄酮浓度，以收集液体积为横坐标，黄酮浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线。

1.5.4 红树莓籽黄酮洗脱条件确定 以1.5.2节中最佳条件上样，树脂吸附完全后，用去离子水洗至流出液无色，用150 mL乙醇体积分数分别为50%，60%，70%，80%，90%，以 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL/min的流速洗脱，收集流出液，前10 mL弃去，测定黄酮浓度，计算解吸率。按公式（2）计算解吸率[19]。

式中，C0——提取液中黄酮质量浓度（mg/mL）；C1——吸附后提取液中黄酮质量浓度（mg/mL）；C2——解吸后提取液内黄酮质量浓度（mg/mL）；V1——上样液体积（mL）；V2——洗脱液体积（mL）。

1.5.5 验证试验 以上述试验中得到最佳条件纯化红树莓籽黄酮，测定其吸附率和解吸率，并将纯化的黄酮液旋转蒸发至膏状，并置于真空冷冻干燥机中干燥24 h，取一定量纯化干粉和1.3.3节中粗黄酮粉分别用无水乙醇溶解测定黄酮浓度，比较二者黄酮纯度[20]。按公式（3）计算纯度。

式中，C——测定液黄酮质量浓度（mg/mL）；V——测定液体积（mL）；m——黄酮干粉质量（mg）。

1.6 红树莓籽黄酮体外结合胆酸盐效果评价

1.6.1 不同提取方式对红树莓籽黄酮体外结合胆酸盐效果的影响 分别取一定量1.3.3节中醇提黄酮干粉，1.4节中AB-8纯化黄酮干粉和1.5.5节中聚酰胺纯化黄酮干粉溶于乙醇，配制成5 mg/mL样液，取1 mL于具塞试管中，加入4 mL胆酸盐溶液（0.3 mmol/L、pH 6.3的胆酸钠、甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠溶液），在37℃恒温振荡1 h后6 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL加入7.5 mL 60%硫酸溶液，置于70℃水浴20 min，取出冰浴5 min，在波长387 nm处测定吸光度，以无水乙醇替代样液作为空白组，以磷酸盐缓冲液替代胆酸盐作为空白对照组，计算样品对胆酸盐的结合率[21]，按公式（4）计算。

式中，A0——空白组；A1——样品组；A2——空白对照组。

1.6.2 不同红树莓籽黄酮质量浓度对体外结合胆酸盐效果影响 将1.5.5节中聚酰胺纯化所得黄酮干粉溶于乙醇，分别配制成 1，3，5，7，9 mg/mL的样液，分别取不同质量浓度样液各1 mL于具塞试管中，余下操作同1.6.1节的方法，计算胆酸盐结合率，考察不同质量浓度红树莓籽黄酮对胆酸盐结合效果的影响程度。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁的质量浓度为x轴，该质量浓度下的吸光值为y轴，绘制的芦丁标准曲线如图1。芦丁标准品在0.004～0.020 mg/mL质量浓度范围内，线性关系良好，芦丁标准曲线为y=7.75x+0.047，R2=0.9996，可用于红树莓籽黄酮质量浓度测定。

2.2 聚酰胺纯化红树莓籽黄酮最佳工艺条件

2.2.1 上样量对红树莓籽黄酮吸附效果影响 上样量对红树莓籽黄酮吸附效果影响如图2所示，随着收集流份的增加，红树莓籽黄酮质量浓度逐渐增大，当收集到第9管时黄酮质量浓度达到初始的十分之一，树脂达到了泄漏点，超过9管后黄酮质量浓度继续增大，可能是树脂已吸附饱和，再继续上样吸附效果减弱，会发生泄漏，为避免黄酮样液浪费，上样液体积确定为100 mL。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

图2 泄漏曲线Fig.2 The curve of adsorption leakage

2.2.2 上样pH值对红树莓籽黄酮吸附率影响 上样pH值对红树莓籽黄酮吸附率如图3所示。随着pH值的升高红树莓籽黄酮的吸附率逐渐增加，当pH值达到4.5时，吸附率达到最大67.26%，而后吸附率开始缓慢降低，这可能是因为黄酮类化合物为多羟基酚类，呈弱酸性，酚羟基与聚酰胺以氢键的形式结合，在弱酸性或酸性条件下吸附效果较好，碱性增强，酚羟基上的氢解离形成酸根离子，与树脂结合力减弱，吸附率降低[22]。因此选择pH 4.5为最佳上样pH值。

2.2.3 上样流速对红树莓籽黄酮吸附率影响 上样流速影响溶质向树脂内表面扩散，决定吸附效果。流速过大，黄酮样液与树脂接触不充分，提早泄露，吸附率降低；流速过小，吸附时间延长，生产效率低[23]。由图4可知，随着上样流速的增加吸附率逐渐降低，流速为1.5 mL/min与2.0 mL/min的吸附率无显著差异，考虑提高试验效率，选择2.0 mL/min为最佳上样流速。

图3 上样pH值对红树莓籽黄酮吸附率影响Fig.3 Effect of sample pH on the adsorption of flavonoids

2.2.4 洗脱剂用量对红树莓籽黄酮洗脱效果影响 聚酰胺纯化红树莓籽黄酮洗脱曲线如图5，随着洗脱剂用量的增加，黄酮质量浓度显著升高，当洗脱体积为60 mL时，黄酮质量浓度达到最大值，而后黄酮质量浓度逐渐降低，当洗脱剂用量为150 mL时，黄酮质量浓度几乎为0，因而选取150 mL为最佳洗脱剂用量。

图5 洗脱曲线Fig.5 Desorption curve

图6 洗脱流速对红树莓籽黄酮解吸率影响Fig.6 Effect of ethanol flow rate on the desorption rate

图4 上样流速对红树莓籽黄酮吸附率影响Fig.4 Effect of flow rate on the adsorption of flavonoids

2.2.5 洗脱流速对红树莓籽黄酮解吸率影响 由图6可知，当流速在0.5～1.0 mL/min范围内解吸率迅速降低，而后随着洗脱流速的增加，解吸率缓慢降低。洗脱流速过快，洗脱不完全，流速过慢则洗脱过程耗时较长，效率降低，不适于工业化生产[24-25]，洗脱流速为1.5mL/min时解吸率为51.92%，综合考虑试验效率和解吸率，选择1.5 mL/min为最佳洗脱流速。

2.2.6 乙醇体积分数对红树莓籽黄酮解吸率影响 不同体积分数乙醇对红树莓籽黄酮解吸率影响如图7所示。随着乙醇体积分数的增大解吸率显著上升，当体积分数为70%时解吸率达到最高而后解吸率迅速降低，乙醇是极性溶剂，体积分数越大极性越小，极性小容易将杂质洗脱下来与黄酮竞争同种溶剂，从而解吸率降低[26]。因此确定70%乙醇为最佳洗脱浓度。

图7 乙醇浓度对红树莓籽黄酮解吸率影响Fig.7 Effect of ethanol concentration on the desorption rate

2.2.7 红树莓籽黄酮聚酰胺纯化工艺验证 根据上述试验结果，采用最佳吸附条件和解吸条件重复3次验证试验，得到聚酰胺纯化红树莓籽黄酮的吸附率为68.7%，解吸率为76.3%，将所得洗脱液浓缩、冻干后，得到纯化的黄酮粉末，纯度由醇提的25.07%提高至59.20%，产品纯度提高了2.36倍，说明该试验条件稳定可行，可有效纯化红树莓籽黄酮。

2.3 红树莓籽黄酮体外结合胆酸盐能力评价

2.3.1 不同提取方式对红树莓籽黄酮体外结合胆酸盐能力影响 由图8可知，不同提取方式对胆酸盐结合能力差异显著，聚酰胺纯化黄酮对胆酸钠结合能力最强达48.8%，大孔树脂纯化黄酮对甘氨胆酸钠的结合能力最强达44.8%，3种黄酮对牛磺胆酸钠的结合能力均较低，其中，聚酰胺纯化黄酮对其结合能力最高达24.46%。聚酰胺纯化黄酮对3种胆酸盐结合能力均较高，其次是大孔纯化黄酮，最后是醇提黄酮。

2.3.2 不同红树莓籽黄酮质量浓度对体外降血脂影响分析 不同质量浓度红树莓籽黄酮与胆酸盐结合能力如图9所示，随着黄酮质量浓度升高结合率也逐渐上升。红树莓籽黄酮对甘氨胆酸钠的结合率始终高于牛磺胆酸钠，当黄酮质量浓度为5 mg/mL时，对胆酸盐结合率由大到小依次为胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠。黄酮质量浓度为9 mg/mL时，对甘氨胆酸钠的结合率最高为86.27%，胆酸钠与牛磺胆酸钠结合率相近为75.37%和75.47%。从整体来看，红树莓籽黄酮对甘氨胆酸钠结合效果最好，其次为胆酸钠和牛磺胆酸钠。红树莓籽黄酮质量浓度在1～9 mg/mL范围内，对甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠和胆酸钠的结合能力呈线性关系，R2分别为0.9721，0.8926和0.9852，线性关系较好，达到相应胆酸盐半数抑制率（Half maximal inhibitory concentration，IC50）的红树莓籽黄酮质量浓度依次为2.911，3.779，3.257 mg/mL，说明红树莓籽黄酮对胆酸盐结合能力较强，具有一定降血脂功效。

图8 不同提取方式红树莓籽黄酮对胆酸盐结合率影响Fig.8 Effects of red raspberry seed flavonoids extraction methods on ability of bile salt-binding

3 结论

聚酰胺纯化红树莓籽黄酮最佳条件为：上样质量浓度5.5 mg/mL、上样量100 mL、上样pH 4.5、上样流速2.0 mL/min、洗脱体积分数70%乙醇、洗脱剂用量150 mL、洗脱流速1.5 mL/min，此条件下红树莓籽黄酮纯度由醇提的25.07%提高到59.20%，提高了2.36倍。经聚酰胺纯化后红树莓籽黄酮对甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠和胆酸钠的IC50依次为2.911，3.779，3.257 mg/mL，说明红树莓籽黄酮对胆酸盐有较好结合能力，可为开发天然降血脂药物提供理论依据。