李 鹏 孙京新* 冯 婷 王淑玲 黄 明 徐幸莲 周兴虎

（1 青岛农业大学食品科学与工程学院 山东青岛 266109

2 南京农业大学 国家肉品质量安全控制工程技术研究中心 南京 210095

3 南京农大肉类食品有限公司 南京 210095）

腌制是贮藏肉制品最古老的方法之一。随着肉制品加工技术的不断发展，人们对肉的腌制有了新的认识，腌制除了能够延长肉的贮藏期外，其对肉制品的加工工艺和产品特征有重要作用，比如提高肉的保水性、凝胶性以及改善肉的色泽、增加肉的香味等[1]。食盐用于肉品腌制，其主要作用之一就是促进肌肉组织中的盐溶性蛋白质的溶出，这些蛋白的溶出能够增加肌肉颗粒的黏合作用，提高乳化性和保水性，降低蒸煮损失，从而提高最终产品的品质特性[2]。然而，如果腌制过程中没有能够促进食盐快速渗透的有效手段，就会造成食盐渗透缓慢，腌制时间过长等一系列问题，从而影响产品品质，甚至导致肌肉腐败变质，因此探索理想、高效的腌制工艺，受到越来越多的学者和生产者的关注[3-4]。

滚揉是一种动态腌制工艺，其通过较强的机械力作用造成肌肉纤维断裂和肌细胞物理性损伤，同时促进食盐等腌制液的渗透，并能减少腌制过程中细胞内水分的损失，降低蒸煮损失，提高产品嫩度，目前已被广泛应用于肉制品的生产中[5]。实际生产中应用较成熟的滚揉工艺是真空滚揉，其能够提高腌制效率，改善原料肉的原有组织结构、性能，使之具有良好的加工特性。谢媚等[6]研究发现，利用真空滚揉技术能够改善鹅肉的嫩度，以及对鹅肉蛋白质降解产生影响，并且重度的真空滚揉效果更加显著。杨秋丽等[7]在腊板鹅的加工过程中，发现通过真空滚揉能够提高组织蛋白酶B（Cathepsin B）、钙激活酶（Calpain）和细胞凋亡酶-3（Caspase-3）的活力，加速蛋白质降解，缩短腌制周期，改善产品亮度。然而，在较长时间的真空滚揉腌制过程中，由于机械作用，肉块温度极易升高，从而导致微生物繁殖及肌肉热变性，因此需将产品在2～4℃下滚揉；此外，真空滚揉过程中真空度的控制也是关键因素，否则会导致肌肉过度失水，降低产品品质[8]。变压滚揉是指在滚揉过程中将真空滚揉和常压或加压滚揉交替进行，使肉块处于适当压迫和疏张交替作用中，从而造成肉块所受压力呈不断的周期性变化，腌制液也经历吸入和挤出的交替运动过程。詹文圆等[9]在滚揉机里通入CO2和N2调整滚揉压力，对猪肉进行滚揉腌制处理，发现其腌制效率和抑菌效果要优于传统的真空滚揉腌制；然而加压滚揉对于滚揉设备的材料和使用条件要求严格，在实际操作中存在不便。超声波技术可以通过空穴作用，对肌肉组织起到嫩化作用，目前作为一种新兴的高效、环保、非侵入性的加工技术，在肉品加工领域开展了一些研究，并取得良好的效果[3]。Jayasooriy等[10]对生鲜鸡肉进行超声波处理，发现超声波能增强肌原纤维的断裂程度，并导致其剪切力显著下降。在超声波与滚揉技术结合对鸡肉[11]、鸭肉[12]腌制的研究中发现，超声波辅助滚揉能够加速鸡肉、鸭肉的腌制速率，提高腌制液吸收率，并且对于其色泽、嫩度、熟肉率、质构等食用品质均有明显改善。

目前国内外有关滚揉腌制工艺的研究较多，超声波技术在肉品加工领域也受到越来越多的关注，然而，在实际应用中，长时间真空滚揉以及超声波技术都容易产生热量，使原料温度升高，从而导致微生物生长与产品品质劣变[9，13]。适用于工厂连续生产的滚揉与超声波结合的技术、设备的研究和应用还未见报道。本研究从解决传统真空滚揉腌制时间长，加压滚揉要求高，超声波易产热等问题出发，拟利用超声波技术结合真空与常压滚揉交替腌制处理，帮助滚揉腌制的呼吸以及热量及时排出，通过测定不同腌制方法对鸭肉蛋白质和水分改变，研究超声辅助变压滚揉对腌制过程中肌肉的品质影响及作用机理，从而为研究新的肉品加工技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

新希望六和鸭胸肉，当地大型超市；食盐、复合磷酸盐、抗坏血酸钠、亚硝酸钠均为食品级；聚乙烯自封袋，佛山市超盛包装材料有限公司；高分子量标准蛋白，天根生化科技（北京）有限公司；十二烷基磺酸钠（SDS），迪申生物技术（上海）有限公司；考马斯亮蓝、EDTA、氢氧化钠等试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GR-20型真空滚揉机，诸城新得利食品机械公司；JY92-IID超声波乳化机，宁波新芝有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一生物科技有限公司、电子数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司；梅特勒ML104T电子天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；Labram HR800拉曼光谱仪，法国Horiba Jobin Yvon公司；PQ001核磁共振分析仪，苏州纽迈分析仪器有限公司；海尔BCD-216SDN冰箱，青岛海尔有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 腌制液的配制 腌制液的配方参考冯婷等[13]方法，溶液配制完成经充分溶解，置于0～4℃冷藏备用。

1.3.2 肉样的处理 将冷冻鸭胸肉解冻，修整成大约5 cm×5 cm×2 cm、质量50 g样品，浸渍于装有腌制液（料液比 1∶2，g/mL）的自封袋中，分成两组，分别进行如下处理：

真空滚揉腌制（Vacuum tumbling，VT）：滚揉参数参考冯婷等[11]和Patra scu 等[14]方法，略作修改，真空度为0.08 MPa，温度0～4℃，转速16 r/min。随机挑选分装好的样品15份，将其放入滚揉机中，采用单向连续真空滚揉方式分别处理20，40，60，80，100 min，同时取 3 份未进行滚揉处理（0 min）的作为对照组，每个时间点随机取出3份样品分析（即为3个重复）。

超声波辅助变压滚揉腌制（Pressure-transform tumbling curing assisted by ultrasound，PTU）：参考冯婷等[11]方法，略作修改。随机挑选分装好的样品15份，将所有样品先放入超声波细胞破碎仪（40 kHz，140 W）中处理 2 min，然后将其置于真空滚揉机（真空度0.08 MPa）单向连续滚揉9 min，然后去掉真空恢复常压状态，再单向连续滚揉9 min，从而完成一个PTU处理周期；再重复上述滚揉周期1，2，3，4次，同时每个滚揉周期取出3份样品，由此可以分别得到经过PTU处理时间为20，40，60，80，100 min的鸭肉样品。未进行超声波和滚揉处理（0 min）的原料鸭胸肉为对照。

真空与常压交替的变压滚揉腌制处理试验本研究室前期已完成，结果显示经过相同处理时间其与真空滚揉相比腌制效果差异不显著（数据还未发表）。在长时间滚揉过程中，采用变压技术能够通过气体交换，有效降低原料温度，因此本文采用超声波辅助变压滚揉技术与传统真空滚揉进行比较研究。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析 分别取不同滚揉方式、不同处理时间的鸭肉样品各2 g，参考Siró等[3]的方法提取鸭肉组织的肌原纤维蛋白，进行SDS-PAGE电泳分析。电泳条件：采用丙烯酰胺质量分数为10%的分离胶、丙烯酰胺质量分数为5%的浓缩胶，分子质量范围在10.0～200.0 u的高分子质量的标准蛋白。浓缩胶中采用电压80 V，进入分离胶后电压120 V。

1.3.4 拉曼光谱分析 用于拉曼光谱分析的鸭肉肌原纤维蛋白提取及预处理方法参考谢媚等[6]的研究方法，分别对经过真空滚揉和超声波辅助变压滚揉处理100 min的样品进行处理，将得到的肌原纤维蛋白溶液稀释，质量浓度为40 μg/mL，置于4℃冰箱备用。拉曼光谱分析参考Xu等[15]的方法，采用Labram HR 800激光拉曼分析仪（带514.5 nm氩离子激光）进行测试，每个样品测定3次。根据苯丙氨酸的单基取代苯基环在1 003 cm-1伸缩振动强度作为内标进行归一化，采用自带Labspec软件对图谱进行基线校正和平滑处理，同时指认肽键骨架振动和氨基酸侧链光谱条带[16]。参考Alix等[17]的方法，计算不同处理下鸭肉蛋白质的二级结构α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构含量的变化。

1.3.5 水分分析 参考 Han等[18]和李鹏等[19]方法，采用LF-NMR技术分析不同滚揉处理鸭肉中水分状态变化。横向弛豫时间（T2）在台式脉冲NMR PQ001分析仪上测量，测量温度设为32℃，质子共振频率为22.6 MHz。将0.5 g的样品放入直径12 mm的玻璃样品管中，再将其放入直径15 mm的核磁管中进行分析；弛豫时间T2用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill（CPMG）序列进行测量。

1.3.6 统计分析 本研究每个试验进行3次重复，数据结果以平均值±标准偏差表示，采用SPASS 19.0进行显著性分析，P<0.05时差异显著。

2 结果与分析

2.1 滚揉处理对鸭肉肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳的影响

肌原纤维蛋白是一类具有重要生物学功能特性的结构蛋白，占全蛋白总量的50%～55%，对肉制品的保水性、黏结性、弹性、热诱导凝胶等有重要影响，能够决定最终产品的质构、产量等[18]。由图1可见，不同滚揉腌制处理导致鸭肉肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳条带发生明显变化。其中，随着滚揉时间的延长，代表较大分子质量的肌球蛋白重链（MHC）、肌间线蛋白/结蛋白（Desmin）、肌钙蛋白T、原肌球蛋白条带逐渐减弱，而分子质量较小的蛋白条带，如肌球蛋白轻链（MLC1和MLC2）、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C等电泳条带明显增强。产生这个现象的原因主要是在滚揉过程，肌肉组织受到摔打、碰撞、挤压作用使得肌细胞膜和肌纤维发生破裂；此外，经过滚揉使肌细胞中的一些内源性蛋白酶得到更大释放，从而作用于肌原纤维蛋白，加速蛋白质的降解。同时比较这两种滚揉处理，可以看出，相同的处理时间，PTU处理组的肌原纤维蛋白的变化趋势更为明显，说明PTU处理能够加速腌制过程鸭肉蛋白的降解速率。原因可能是超声波的力学效应强化了细胞内外的质量传输，迅速破坏了肌膜结构，使得更多的蛋白及内源性蛋白酶在短时间内溶出，提高了蛋白酶的活性，增加酶促反应速率[20]；此外，由于变压滚揉过程中真空滚揉和常压滚揉交替进行能够造成肉块所受的压力不断发生无规则变化，使得细胞内外的渗透平衡不易建立，促使渗透-溶出作用可以持续进行，从而加速了蛋白的溶出和降解[9]。

2.2 滚揉处理对鸭肉蛋白拉曼光谱的影响

图1 不同滚揉腌制处理的鸭肉肌原纤维蛋白SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE pattern of myofibrillar proteins in duck after treated by different tumbling curing treatment

鸭肉中含量最高的蛋白质是肌原纤维蛋白，其在鸭肉加工过程中容易发生降解，蛋白质结构发生变化，从而影响鸭肉的品质特性和理化特性[21]。Wang等[22]利用拉曼光谱技术对不同待宰静养的鸡肉蛋白结构进行分析，发现不同宰前静养措施能够引起蛋白质二级结构的变化，α-螺旋和β-折叠含量呈显著差异，从而影响鸡肉的品质特性。周昌瑜等[23]通过拉曼光谱对不同热处理的鸭肉肌原纤维蛋白进行检测，发现热处理导致肌原纤维蛋白α-螺旋结构和β-折叠、β-转角结构发生显著变化，从而对鸭肉风味产生影响。本研究对不同滚揉腌制处理的鸭肉蛋白进行拉曼光谱检测，通过与谢媚等[6]和李鹏等[19]研究结果进行比对分析，不同滚揉处理鸭肉的拉曼光谱如图2所示，蛋白质拉曼光谱谱带的指认如表1所示。

酰胺Ⅰ带（1 600～1 700 cm-1）是反映蛋白质二级结构的主要谱带[6，23]，α-螺旋结构特征峰主要集中在1 645～1 657 cm-1范围内；β-折叠结构特征峰主要在1 665～1 680 cm-1；β-转角结构主要在1 680 cm-1附近；无规则卷曲结构主要在1 660～1 665 cm-1附近[18，24]。 本研究对鸭肉进行不同滚揉腌制处理，对处理后鸭肉肌原纤维蛋白的二级结构组成及含量进行分析，结果如表2所示，可以看出滚揉处理对蛋白质的二级结构的相对含量产生显著影响（P<0.05）。未经滚揉的鸭肉中α-螺旋结构含量最高，可达75.79%，而β-折叠、β-转角和无规则卷曲相对较低；经过真空滚揉和超声波辅助变压滚揉处理100 min后，α-螺旋结构分别降至39.09%和21.75%，而β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构的含量显著增大（P<0.05），其中超声波辅助变压滚揉样品各结构含量变化最大，该结果表明滚揉处理能够引起蛋白质结构的变化。原因可能是超声波辅助变压滚揉通过物理破坏和超声的空化效应导致蛋白质α-螺旋结构的破坏或者部分α-螺旋结构转化为其它结构，从而影响鸭肉的相关加工特性[6，19]。

图2 不同滚揉处理后鸭肉蛋白的拉曼光谱图Fig.2 Raman spectra of duck’s muscle treated by tumbling curing

表1 鸭肉蛋白质拉曼光谱条带指认Table1 Assignment of bands in the Raman spectra of duck muscle

表2 滚揉处理对鸭肉蛋白质二级结构相对含量的影响（%）Table2 The effect of tumbling treatment on relative changes in the secondary structure content of duck’s muscle proteins tumbling treatment（%）

2.3 不同滚揉腌制处理对鸭肉水分状态的影响

2.3.1 对鸭肉横向弛豫时间T2的影响 图3为经过不同滚揉腌制处理鸭肉中水分状态变化的弛豫图谱，可见，在1～1 000 ms的弛豫时间内有4个峰，其横向弛豫时间分别为T20（0.1～1.5 ms），T21（2～10 ms），T22（10～100 ms），T23（100～1 000 ms），分别代表结合水、中度结合水、不易流动水和自由水[24-25]，该结果与李春等[26]用LF-NMR研究不同冷却条件下猪肉水分分布的结果基本一致。同时由表3可知，滚揉后 T20显著降低（P＜0.05），而两种滚揉处理间 T20，T21差异不显著（P＞0.05），即表明两种滚揉方式对鸭肉结合水的影响不显著；两种滚揉处理导致T22显著增加（P＜0.05），同时PTU处理导致 T23显著降低（P＜0.05）。 T21和T22的下降说明PTU处理能降低肌肉中水分自由度，增强中度结合水和不易流动水与蛋白质的结合能力；原因可能是滚揉处理导致肌原纤维蛋白空间构象发生变化，从而增强肌肉的保水性。张骏龙[27]在研究淀粉对肉糜保水性时也发现，随着淀粉含量的增加，弛豫时间T21、T22呈逐渐下降的趋势，从而有助于提高肉糜体系中不易流动水与蛋白质的结合能力，使肉糜体系变得更为紧密牢固，原因可能是由于淀粉对肉糜的凝胶性造成影响。T23代表肌肉中的自由水群，PTU后下降为231 ms，显著高于对照和VT处理组（P＜0.05），而对照和VT处理组之间无显著差异，其变化趋势可能与滚揉对肌浆蛋白的变性有关[28]。

图3 不同滚揉处理鸭肉的弛豫时间T2图谱Fig.3 The transverse relaxation time T2plot of duck muscle by different tumbling treatment

2.3.2 滚揉对鸭肉横向弛豫时间T2峰面积的影响 肉和肉制品中横向弛豫时间T2的大小可以反映水分的自由度，T2时间越长水分的自由度越高；此外，不同弛豫时间 T20，T21，T22和T23所相对应的峰面积比P20，P21，P22和P23分别代表4种不同状态水分的相对含量，通过相对含量的变化可以反映肉中不同状态水分的相互转化情况，从而表征肉的保水性变化[29]。表4所示为不同滚揉处理后鸭肉样品的横向弛豫时间T2所对应峰面积P20，P21，P22和P23变化情况，经PTU处理的鸭肉P21和P22增加最大（P＜0.05），同时 P23降低幅度最大（P＜0.05）。有研究表明，P21和P22与肌肉的保水性呈正相关，P23与保水性呈负相关[30]，这与本研究结果相一致。这可能是一方面由于滚揉破坏了肌肉细胞结构，导致更多的盐溶性蛋白溶出，提高保水性；另一方面超声波的空化作用能够引起肌原纤维溶胀以及盐溶性蛋白的溶出，提高肌肉的吸水能力，从而增加肌细胞内水分含量[31]。

表3 滚揉处理对鸭肉中不同状态水分的弛豫时间的影响Table3 The effect of tumbling treatment on relaxation time for water of duck’s muscle

表4 滚揉处理对鸭肉中不同水分弛豫时间T2峰面积的影响Table4 The effect of tumbling treatment on the peak areas for different water of duck’s muscles

3 结论

本研究利用超声波辅助变压滚揉技术对鸭肉进行腌制处理，发现较真空滚揉腌制，超声波辅助变压滚揉能够加速肌原纤维蛋白的降解，加速腌制速率，改善产品品质。超声波辅助变压滚揉能够改变肌肉蛋白质二级结构，减少α-螺旋结构，增加了β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构；超声波辅助变压滚揉也提高了鸭肉中横向弛豫时间T21和T22，以及所对应的峰面积P21和P22，有助于提高肌肉的保水性，改善产品加工特性。