蔡琪琪 周康熙 刘志彬 张 晨 张 雯 倪 莉

（福州大学食品科学技术研究所 福建省食品生物技术创新工程技术研究中心 福州 350108）

红曲黄酒是中国黄酒的典型代表，因添加了红曲酿造，增加了酒体中的活性组分而备受推崇[1-2]。红曲霉是红曲的优势菌，在红曲黄酒的酿造过程中发挥着重要作用。其一，红曲霉作为红曲黄酒酿造体系中的主要产色菌，其发酵产生的红曲色素（包括黄色素、橙色素、红色素3大类）可以赋予红曲黄酒特征的外观颜色[3]；其二，红曲霉的次级代谢产物（红曲色素、莫纳克林K、γ-氨基丁酸、麦角固醇等）丰富了酒体的活性成分，增加了红曲黄酒的保健功能[4]；其三，红曲霉强大的酶系能够催化底物生成醇类、酯类、有机酸等风味物质，丰富了酒体的口感和芳香[5]。

由于红曲霉对红曲黄酒的色、香、味及保健功能等品质做出了较为突出的贡献，因此探明传统酿造过程中红曲霉的动态变化和生长机制尤为重要。黄志清等[6]、蔡琪琪等[7]的研究发现红曲霉在红曲黄酒传统酿造过程中的菌量呈不断下降的趋势，对其原因并未深入探究。针对红曲霉生长的抑制因素，除了营养物质的消耗之外，其它微生物的生长代谢也可能会对红曲霉的生长产生影响。贾瑞博等[8]通过变性凝胶电泳技术揭示了红曲黄酒酿造过程中的优势细菌为乳杆菌，发酵液酸度的增加可能会抑制红曲霉的生长[9]；牟穰等[10]通过宏基因组学技术对海派黄酒酿造过程中真菌菌群动态进行跟踪测定，试验结果表明曲霉属的相对丰度随酿造时间的延长有所下降，并指出影响其变化的原因可能与酸度、酒精度的增加有关。有学者表明，红曲黄酒酿造过程中pH值的变化在3.5～5.5范围内[11]，此酸度适宜红曲霉的生长繁殖[12]，且适宜浓度的酸、醇能够促进高温型红曲霉的生长[13]。此外，酿造过程中的其它因素亦可能对红曲霉产生影响，这使得红曲霉与其生长抑制因素之间的关系变得复杂。

为探明红曲黄酒酿造过程中红曲霉的主要抑制因素，本研究将采用分子生态学PCR-DGGE技术及实时荧光定量PCR技术相结合的方法，对平湖红曲黄酒酿造过程中的真菌菌群动态进行定性、定量分析，并根据红曲霉菌量不断减少的趋势推测其中可能的原因，同时构造相应的体系进行验证，寻找影响红曲霉生长的关键因子，为探究红曲霉在发酵过程中的作用机制以及改善红曲黄酒的品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

平湖红曲（Q01），福建省古田县平湖红酒曲有限公司；红曲霉C1，由平湖红曲中分离纯化而得，编号C1，由福州大学食品科学技术研究所保藏[14]。圆糯米，福州市闽侯县上街镇粮油站；真菌基因组提取所需试剂、引物、PCR试剂盒、DNA Maker，上海生物工程有限公司；其它试剂均为分析纯级。

糯米培养基：用于液化液的制备；糯米和水按质量比1∶1.5的比例混合，在室温下浸泡8 h，121℃蒸煮20 min。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-IFD型超净工作台，上海博讯实业；GNP-9080型恒温培养箱，上海精宏；BIO-RAD DcodeTM型梯度变性凝胶电泳，美国伯乐公司；琼脂糖水平板电泳仪，北京六一公司；JS-380C型凝胶成像分析仪，上海培清；7890A气相色谱仪，安捷伦。

1.3 试验方法

1.3.1 平湖红曲黄酒酿造及取样过程 将糯米浸泡蒸熟摊凉后，与研磨浸泡后的平湖红曲（Q01）搅拌均匀，放入灭菌后的酒坛中，25℃糖化5 d，再调整温度为18℃，密封发酵25 d。红曲与糯米按质量比1∶10添加，糯米与水添加比例为质量比1∶1.5。取样时间点设置为发酵前期（第1～7天）、中期（第 10 天）、后期（第 20、30 天）。

1.3.2 发酵样品预处理 发酵样品搅拌均匀后，取2.00 g，称于20 mL无菌生理盐水中，振荡均匀后分装于2 mL离心管中，12 000 r/min离心10 min，弃上清后，沉淀放置-20℃冰箱中冻存备用。

1.3.3 孢子悬浮液的制备 红曲霉C1活化结束后，用孢子洗脱液洗下孢子，转入带有玻璃珠的三角瓶中，振荡，充分打散孢子，用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，利用血球计数板在光学显微镜下计数，制成终浓度为106个/mL的均一孢子悬液，备用。

1.3.4 各体系红曲霉菌量变化的跟踪方法 样品真菌基因组DNA的提取及实时荧光定量PCR分析详见参考文献[14]。

1.3.5 发酵体系的构建 模拟传统：30 g蒸熟糯米、3 g红曲和45 mL无菌水，三者的质量比与酒坛酿造一致。

纯菌发酵：30 g蒸熟糯米、3 mL纯菌红曲霉（C1）菌液，补水至与模拟传统体系同体积。

体系1（除去曲米）：30 g蒸熟糯米、红曲处理上清液（3 g红曲研磨后加生理盐水充分振荡，静置分层，取上清液加入），补水至与模拟传统体系同体积。

体系2（抑制因子）：30 g蒸熟糯米、无菌的红曲处理上清液（3 g红曲研磨后加生理盐水充分振荡，静置分层，取上清液用0.22 μm的无菌滤膜过滤）、3 mL纯菌红曲霉（C1）菌液，补水至与模拟传统体系同体积。

体系3（不同酒精度）：30 g蒸熟糯米、3 mL纯菌红曲霉（C1）菌液、不同体积的乙醇，补水至与模拟传统体系同体积，最终乙醇的体积分数分别为0，4%，13%，16%，25%，50%。

以上均在100 mL的锥形瓶中30℃下培养。

1.3.6 酒精度的测定 采用填充柱气相色谱法[15]。

（1）色谱条件 色谱柱：10%PEG填充柱；载气：N2；进样量：1 μL；空气流速：0.2 MPa；H2流速：0.05 MPa；载气流速：0.3 MPa；气化室温度：230℃；柱温：80℃；检测器温度：250℃。

（2）标曲的绘制 吸取无水乙醇配制成质量浓度分别为0，1.0000，1.5000，2.0000，2.5000，3.0000，4.0000 g/L的乙醇工作液，同时配制2.0000 g/L的正丙醇标准液，分别将各质量浓度的乙醇工作液与正丙醇标准液等体积混合后进样，每个样品重复2次，得到各质量浓度的乙醇工作液与正丙醇标准液的峰面积比Ai/As，以标样的峰面积比值的平均值为横坐标，乙醇的质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 平湖红曲黄酒酿造过程中优势真菌菌群的变化

2.1.1 优势真菌菌群结构分析 以NS1/GCFung作为引物扩增平湖红曲黄酒各个酿造时间点所提真菌基因组的18S rDNA序列可变区，所得PCR产物进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析。

在DGGE图谱（图2）中，平湖红曲（泳道Q01）检测到一条高亮条带（Band 2），而平湖红曲黄酒酿造过程中具有处于不同位置的2个高亮条带（Band 1和Band 2），说明Band 2对应的菌株在平湖红曲中属于优势菌，并且Band 1对应的菌株也存在于平湖红曲中，并非优势菌，其提取效率低，因此Band 1在Q01泳道中条带不明显。

以纯菌酿酒酵母NY02（Saccharomyces cere-visiae）及纯菌红曲霉 B1（Monascus sp.）的DGGE条带作为参照，发现Band 1和Band 2分别与两纯菌条带处于同一位置，结合前期对平湖红曲的真菌菌群结构分析[21]，可以确定平湖红曲黄酒酿造过程中的优势真菌主要是酿酒酵母和红曲霉，说明平湖红曲在进行传统酿造过程中，与其它黄酒体系相比，真菌体系较为简单[16]。

图1 乙醇标准曲线Fig.1 Standard curve of ethanol content

此外，观察酿造过程中的菌群动态变化，发酵前3 d，红曲霉为绝对优势菌，至发酵第4天后，酵母菌对应的条带逐渐变亮，红曲霉对应的条带逐渐变暗，甚至几乎消失，酵母逐渐取代红曲霉作为酿酒的优势菌，可能与酿造过程中的环境变化有关，也可能与两者生长周期和生长能力不同有关[17]。

通过DGGE的定性分析可知，平湖红曲黄酒酿造过程中的优势菌为红曲霉和酿酒酵母，欲探知两种优势菌的菌群数量变化，还需结合实时荧光定量PCR技术对其进行定量追踪。

2.1.2 优势真菌菌群数量变化 采用特异性引物Mp-F/Mp-R和SC1d/SC1r分别对平湖红曲黄酒各个酿造时间点的红曲霉和酿酒酵母菌量进行检测，结果如图3所示：两种优势菌的变化趋势与DGGE结果相符，酿酒酵母在发酵前期基本检测不到，到第2天之后迅速增加，至发酵第5天达到5.51log10CFU/g，之后呈现缓慢增加的趋势。红曲霉的数量变化则与之相反，发酵第一天则迅速下降至4.62log10CFU/g，之后在整个发酵过程中呈现缓慢下降趋势，在发酵第10天后下降明显。

图2 平湖红曲黄酒传统酿造过程中真菌菌群结构PCR-DGGE图谱Fig.2 PCR-DGGE profiles of fungal community during the traditional brewing of Pinghu Hongqu glutinous rice wine

由于第0天和发酵过程中的取样方法的差异可能导致发酵第1天的菌量迅速下降。第0天是对红曲进行直接取样处理，而整个发酵过程的取样是对酒坛里的酒醅（曲米混合样）进行取样处理，样品状态不一致，对菌量测定结果有一定差异。然而，在发酵过程中，操作一致的情况下，红曲霉的菌量仍然缓慢下降，酿酒酵母则稳步上升。针对红曲霉菌量下降的可能原因有：（1）红曲霉与酿酒酵母之间存在拮抗作用，酿酒酵母的生长抑制了红曲霉菌量的增加。然而，有部分学者研究表明，上述两种菌可以互利共栖，产生协同作用。Shin等[18]研究表明红曲霉与酿酒酵母纯菌株混合培养时，红曲霉的生物量会增加至原来的两倍左右。周学勤等[19]研究发现酵母菌的添加并不会影响红曲霉生长曲线的基本模式，酵母菌及其细胞破碎液还可以提高红曲霉的色素产量，因此二者相互抑制的可能性不大。（2）红曲霉为好氧菌，由于传统酿造过程中，从发酵第6天开始封罐坛，溶氧量的减少抑制了红曲霉的生长。（3）红曲米对红曲霉的物理性束缚阻碍了红曲霉的生长和释放。红曲本身是在蒸熟的大米上接种红曲霉发酵制备而得，红曲霉菌丝深入到曲米中，生长空间有限，则在发酵过程不易被释放出来。（4）红曲浸泡液中可能存在某些生长抑制因子，抑制了红曲霉的生长。（5）发酵过程中乙醇含量迅速增加，超过了红曲霉的耐受能力，导致红曲霉的生长受到抑制。

基于此，试验将采用小体系的研究方法对红曲霉菌量减少的原因进行细化探究。在进行小体系探究时，除了发酵条件应与传统酿造保持一致，还需要通过试验说明红曲霉能够在小体系的糯米基质上生长，且小体系对于传统发酵的模拟能够重现红曲霉的生长变化规律，这样小体系的构建才有意义。

2.2.1 模拟体系的构建 采用小体系研究方法，利用三角瓶替代传统酒坛进行发酵，发酵过程中红曲、糯米及水的比例均与酒坛酿造一致，糖化时间、密封时间、发酵温度等均严格模拟传统发酵。

模拟传统体系与传统发酵体系相比，虽然在物质传递、群体感应、菌株拮抗、容器渗氧效果等方面可能有所不同[20]，但结合图3、图4可以发现，模拟传统的红曲霉菌量缓慢下降，与酒坛酿造的变化趋势颇为相似，说明模拟传统体系中红曲霉的变化趋势重现性较好，体系构建较为合理，便于后续研究。

2.2 红曲霉的生长抑制因素探究

图3 酿造过程优势真菌的动态变化Fig.3 Dynamic changes of dominant fungal species during fermentation process

另外，在纯菌发酵体系中，红曲霉的菌量逐步增加，说明红曲霉可以依附于糯米基质上生长，并且第6、7天的封坛发酵对红曲霉的生长抑制并不显著，可见在封坛前期溶氧量的暂时减少并不是影响红曲霉生长的关键因子，发酵体系内残余的氧气仍能促进红曲霉的生长繁殖。

针对模拟传统（混菌发酵）和纯菌发酵体系中红曲霉菌量变化的差异，以下将在小体系的基础之上分别构造体系以寻找影响红曲霉生长的关键因子。

图4 模拟传统与纯菌发酵体系中红曲霉菌量变化Fig.4 Dynamic changes of Monascus in two systems（simulation tradition system and pure fungus fermentation system）

2.2.2 曲米的物理束缚对红曲霉生长的影响 体系1是在模拟传统的基础之上，将红曲米进行破碎，提取红曲米中的菌株进行混菌发酵。解除了曲米的物理束缚后，红曲霉的菌量仍然逐渐减少（图5），说明曲米的物理状态并不会对红曲霉的生长起到明显的抑制作用。这可能由于红曲米在制备过程中，将糯米进行蒸煮后，有利于米粒中的游离水与淀粉发生反应，使其糊化，而在糊化过程中，水分子进入微晶结构，打破了淀粉分子之间的联系，使淀粉分子通过水合过程形成胶体体系[21]，该体系的硬度明显降低，减少了曲米中微生物生长的机械阻碍。而曲米中的微生物在生长繁殖过程中，会降解糊化体系中的淀粉，拓宽了微生物的生长空间，干燥后使曲米形成多孔结构，减少了曲米的物理束缚，因而对红曲霉生长的影响较不显著。

2.2.3 曲米浸泡液对红曲霉生长的影响 在红曲米的制备及贮存过程中，曲米内部和表面微生物分泌的代谢产物可能会对红曲霉的生长产生影响，为探究此影响，构建了体系2。该体系在纯菌发酵的基础上加入了无菌红曲处理液，如图6所示。结果表明，体系2的生长曲线与图4中的纯菌发酵体系类似，红曲霉的菌量稳步增加，可见曲米浸泡液中的物质在发酵过程中对红曲霉的生长抑制并不显著，可能由于微生物在生长过程中会通过代谢作用来改变生长环境，从而利于它自身的生长，而DEEG和qPCR的结果均显示红曲霉为红曲米中的优势菌，曲米中积累的物质难以对红曲霉产生明显的负面影响。

图5 体系1中红曲霉的菌量变化Fig.5 Dynamic changes of Monascus in system one

2.2.4 酒精度对红曲霉生长的影响 构建体系3，研究酒精度对红曲霉生长的影响。如图7所示，空白组（KB）和4%酒精度样品组①的糯米上都能布满菌丝，而随着乙醇浓度的增加，糯米培养基上的红色菌丝逐渐减少，表明酒精度的增加对红曲霉的生长有明显的抑制作用。

图6 体系2中红曲霉的菌量变化Fig.6 Dynamic changes of Monascus in system two

图7 体系3中不同酒精度下红曲霉的生长情况Fig.7 The growth of Monascus under different alcohol content

试验进一步对传统酿造过程中酒精度的变化与红曲霉生长的关系进行细化研究。根据传统酒坛酿造过程中酒精的变化情况（图8），将各个取样时间点对应体积分数的乙醇加入带有红曲霉C1孢子液的糯米培养基中，单独发酵3 d，结果如图9所示。

由图9可知，单独发酵第1天红曲霉的菌量就出现明显差异，分别聚集在3个位置：（1）KB和传统发酵第1～3天的酒精度对应的红曲霉菌量最多，且在后续发酵中基本持平，说明酒精度低于4%时，对红曲霉的生长无影响；（2）传统发酵第4～5天的酒精度（9%，12%）对应的红曲霉菌量居中，且在后续发酵中持续上升至与KB相当，有研究表明红曲霉可以耐受10%左右的乙醇[22]，说明此时的酒精度已临近红曲霉的耐受范围，红曲霉的生长开始受到抑制；（3）传统发酵第6～30天的酒精度，这些酒精度下对应的红曲霉菌量最少，且在后续发酵中，第6～10天的酒精度下红曲霉菌量迅速增加，而发酵第20～30天的酒精度下红曲霉的菌量则增加缓慢，抑制作用更明显，该结果与DGGE图谱的菌量变化相一致，即红曲霉的条带在发酵第20天明显变淡。

图8 发酵过程中乙醇的含量变化Fig.8 Changes of ethanol content during the fermentation process

图9 传统酿造中的酒精度变化对红曲霉生长的影响Fig.9 Effect of alcohol content during traditional brewing on the growth of Monascus

3 结论

试验结果表明传统酿造体系的优势真菌为酿酒酵母和红曲霉，其中红曲霉在发酵前3 d占优势，之后其菌量逐渐下降，而酿酒酵母在发酵第3天后逐渐增加，并随着发酵时间的延长逐步取代红曲霉成为酿造中后期的优势菌。在模拟传统和纯菌发酵过程中，模拟传统体系可以重现红曲霉的生长趋势，而纯菌发酵体系说明了封坛前期溶氧量的暂时减少并不能显著抑制红曲霉的生长。根据前期的对比研究，初步推测红曲米的物理束缚、红曲浸泡液中的物质以及酒精度的增加可能会抑制红曲霉生长，针对这3个可能的影响因素构造3种体系，结果发现，前两者对于红曲霉的生长并不会起到显著的抑制作用，而酒精度的增加是影响红曲霉生长的关键因子。试验进一步对传统酿造过程中酒精度的变化与红曲霉生长的关系进行深入研究，结果发现，发酵初期的酒精度（体积分数0～4%）对红曲霉无影响，而随着酒精度的增加，红曲霉的生长逐渐受到抑制，至发酵后期的酒精度（体积分数17%）对红曲霉的抑制作用显著，因而导致红曲霉在DGGE上的条带在发酵第20天明显变淡。