秦利军，赵德刚

1.贵州大学农业生物工程研究院，贵阳市花溪区花溪二道 550025

2.贵州大学山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵阳市花溪区霞晖路1 号 550025

3.贵州省农业科学院，贵阳市花溪区金欣社区1 号 550006

自1983 年Zambryski 等［1］和Benfey 等［2］将根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti 质粒载体上的外源基因导入烟草细胞获得第1 株转基因植物以来，基因工程技术开创了植物遗传改良的新纪元。利用该技术先后创制了γ-亚油酸（γ-linolenic acid，GLA）含量显著增加的转基因烟草（Nicotiana tabacum）［3］、番茄（Solanum lycopersicum）［4］和油菜（Brassica napus）［5］、耐盐耐冷等非生物胁迫能力较高的转基因作物［6-8］，抗Cercospora nicotianae 病害［9］以及低去甲基烟碱累积的转基因烟草［10］。烟草病害是影响烟草生长发育和产量品质的重要因素，而烟草病害中以烟草花叶病毒（TMV）病在世界各烟区的流行性及破坏性最强［11］。因此，挖掘TMV 的抗性烟草种质，利用抗性基因对烟草进行遗传改良是快速、经济的新型育种手段之一［12］。早期分离鉴定的TMV 抗性基因包括黏烟草（Nicotiana glutinosa）的N 基 因［13］、普 通烟草（N.tabacum）Xanthi品种的NH基因［14］及N.tabacum Samsun品种的NL-C26基因［15］，其中N基因和NH基因已被广泛应用于烟草的抗性育种研究中［16-17］。近年来，李梅云等［16］对不同类型烟草种质进行的TMV 抗性比较发现，黄花烟（Nicotiana rustica）及其杂交材料对TMV的免疫性最强。目前已报道的黄花烟（N.rustica）来源的TMV抗性基因为CN基因，分离自HZNH品种。该基因与早期研究的N基因拥有93.63%序列同源一致性的NrCN基因［17］，之后将NrCN 基因导入对TMV敏感的烟草中，发现NrCN 基因能显著提高转基因烟草对TMV 的抗性［18］。虽然利用这些优异抗病基因为创制和培育抗病毒烟草新种质提供了重要的育种策略，但获得的转基因生物通常存在诸多安全性的问题［19-20］。Qin 等［21］在前期研究的基础上，引入了含有“Gene-deletor”的植物表达系统，实现了外源基因在转基因烟草中的定向清除。可见，在提高烟草抗病性的同时，创制品质优质的烟草新种质尤为重要。为此，以前期试验筛选获得的T2代独立转基因烟草植株为材料，通过分析不同转基因烟草株系对TMV的抗性，明确NrCN 导入对转基因烟草光合特征和烟叶化学成分的影响，旨在筛选和培育优质抗病的烟草新种质。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 试验材料

供试材料：普通烟草K326（N.tabacum L.cv.K326）及3 个T1代独立转基因烟草株系Q1、Q2 和Q3 的种子［21］撒播于烟草育苗盘中进行漂浮育苗。转基因烟草植株含有拟南芥（A.thaliana）叶片衰老特异表达基因AtSAG12 启动子PSAG12，可驱动重组酶基因FLP 表达，并清除外源基因。普通烟草（N.tabacum）泛素蛋白基因Ubi 启动子PUbi启动外源筛选报告融合基因Gus::Bar 表达，以及普通烟草（N.tabacum）聚泛素蛋白基因Ubi.U4（GenBank：X77456.1）启 动 子PUbi.U4驱 动 黄 花 烟（N.rustica）TMV 抗性基因NrCN 表达的3 组表达元件，植物表达载体图谱见图1。前期的研究结果Q1 和Q3 株系均含1 个外源基因拷贝（以扩增的部分Ubi.U4-NrCN 片段作为探针杂交得到），而Q2 株系含2个外源基因拷贝［21］。1.1.2 试剂与仪器

植物DNA Kit 购自天根（北京）生物科技有限公司；RNA Kit 购自美国OMEGA Bio-Tek 有限公司；DL 2000 DNA Marker 购自日本Takara（大连）生物公司；MultiScribeTMReverse Transcriptase Kit、Power SYBR®Green PCR Master Mix 购 自 美 国Applied Biosystems 公司；可溶性糖测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；转基因植株检测及抗病相关基因表达分析引物均由上海旭冠生物科技有限公司合成；聚乙氧基月桂醚（brij-35）（北京拜尔迪生物公司）、十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）（分析纯，西陇化工股份有限公司）、柠檬酸（C6H8O7·H2O）（重分析纯，庆川东化工集团有限公司）、对氨基苯磺酸（C6H7NO3S）（天津市科密欧化学试剂有限公司）、二氯异氰尿酸钠（C3O3N3Cl2Na）［阿法埃莎（天津）化学有限公司］、烟碱（C10H14N2，英国BDH 实验室）、烤烟标准样（中国烟草总公司青州烟草研究所）、对羟基苯甲酸酰肼（C7H6O3）（分析纯，西陇化工股份有限公司）。

图1 植物表达载体的构建图谱Fig.1 A schematic diagram of plant expression vector

C1000 TouchTMThermal Cycler PCR 仪 、PowerPac BasicTM凝胶电泳仪和凝胶成像仪ChemiDocTMXRS+（美国BIO-RAD 公司）；7500 荧光定 量PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）；LI-6400 光合测定仪（中国北京力高泰科技有限公司）；Alliance-Futura 连续流动分析仪（深圳市一正科技有限公司）；SKD-20S2 红外石英消化炉（上海沛欧分析仪器有限公司）；Sherwood 420 火焰光度计（上海书俊仪器设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 转基因植株的鉴定

以3～5 叶期的转基因和非转基因烟草幼苗心叶为材料，进行GUS 组织化学染色。剪取烟苗心叶后浸没于GUS 染色液并置于真空仪中，以25 kPa 抽真空15 min 后放入37 ℃恒温培养箱中孵育过夜。次日依次用95%、75%、50%和20%乙醇梯度分别浸提叶片色素，以观察GUS 染色结果。GUS 染 色 液 配 制：100 mmol·L-1Tris-HCl，0.5 mmol·L-1NaCl，0.02 mmol·L-1K3Fe（CN）6，50 mmol·L-1CH3OH，8.65 μmmol·L-1X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸）。按照植物DNA Kit 试剂盒操作说明书提取心叶GUS 染色阳性烟苗的总基因组DNA。以基因组DNA 为模板，利用引 物FUbi.U4（5’-AGGAGCCTCTTTGTTCCC-3’）和RUbi.CN（5’-TCATTCAAACACCACCTCG-3’）对特异性片段（Ubi.U4-NrCN）［807 bp，该片段含550 bp 普通烟Ubi.U4 启动子（PUbi.U4）序列和257 bp 黄花烟NrCN 序列］进行扩增。PCR 扩增条件：94 ℃3 min；94 ℃20 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30 个循环；最终72 ℃保存5 min。

待漂浮盘上烟苗长至3～5 叶期时，每株系（转基因和非转基因）各取15 株长势一致且生长良好的烟苗，分别移栽至含种植基质（菜园土∶Hawita 泥炭土=3∶1）的花盆（高16 cm，直径20 cm，种植基质10 kg）中。每盆施1～2 g 复合肥（N∶P2O5∶K2O=10∶10∶12）作为底肥，盆栽期间追肥1 次。烟草植株在相对湿度为70%～80%，16 h 光照/8 h 黑暗，25～28 ℃条件下培养。烟苗移栽后45 d 时，参照标准方法［22］进行烟草农艺性状指标的测定。

1.2.2 TMV 接种及NrCN 基因表达分析

参照Kasschau 等［23］的半叶枯斑法以6～8 叶期T2代转基因植株（Q1、Q2 和Q3）与非转基因烟苗自下向上数第3 片完展叶进行摩擦接种，每个株系各接种3 株烟。接种后的烟株置于人工培养箱中，在光照1 600～1 800 Lx，温度25～27 ℃，相对湿度＞80%的培养条件培养5 d。之后取烟株（每株系均取3 株）接种部位的临近叶片0.1 g，参照植物RNA Kit 及Reverse Transcriptase Kit 操作说明书提取总RNA，并反转录为cDNA。以烟草肌动蛋白基因β-Actin 为内参基因，用Real-time PCR 分析cDNA 模板中NrCN 基因的相对表达量，每个株系设置3 次重复。NrCN 及β-Actin 特异性扩增引物序列见表1。

表1 Real-Time PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of real-time PCR

1.2.3 转基因烟草烟叶化学成分的测定

1.2.3.1 烟叶取样及预处理

取移栽后50～60 d 的烟株自下向上数13～15 叶位（3 片）烟叶混合后，参照标准方法［24］对烟样进行烘干预处理。混合烟叶置于台式电热恒温鼓风干燥箱［HWXT-9245A，深圳AODEMA（澳德玛）公司］中于110 ℃杀青10 min，再将温度调至80 ℃左右烘至恒质量，用于烟叶化学成分分析。分别取打顶后10 d 和非打顶烟株的相同叶位叶片，按照标准方法［24］（略有改动）进行样品处理与分析，烟叶烘干后放入粉碎机中进行粉碎、研磨，过0.425 mm（40 目）网筛，密封保存备用。每个株系（转基因和非转基因）均选取3 株烟。

1.2.3.2 烟叶化学成分的测定

用Denver Instument 电子天平（0.1 mg，北京丹佛仪器有限公司），精确称取干燥烟粉样品0.25 g至50 mL 的具塞锥形瓶中，参照标准方法［25］测定烟叶总植物碱含量（质量分数）；称取0.10 g 烟粉样品于消化管中，按照标准方法［26］测定烟叶总氮含量（质量分数）；称取烟粉样品0.25 g 至50 mL 的具塞锥形瓶中，加入25 mL水后于室温下振荡萃取30 min，参照标准方法［27］测定烟叶钾离子含量（质量分数）；称取烟粉样品0.25 g 至50 mL 的具塞锥形瓶中，加入25 mL 水后于室温下振荡萃取30 min，按照标准方法［28］测定烟叶氯离子含量（质量分数）。每株烟样重复测定3次，取3次重复的平均值。

1.2.4 转基因烟草烟叶可溶性糖及光合特征指标的测定

准确称取烟样粉末0.1 g，分别加入1 mL 蒸馏水混匀成匀浆，然后倒入有盖的离心管中，95 ℃水浴处理10 min（盖紧，以防止水分散失）。冷却后，以8 000 g、25 ℃离心10 min，取其上清液至10 mL 的试管中，再用蒸馏水定容到10 mL，摇匀后备用。按照可溶性糖测定试剂盒说明书进行测定和计算烟样中可溶性糖含量，每株烟样重复测定3 次，取3 次重复的平均值。

利用LI-6400 光合测定系统测定团棵期（移栽后45 d）烟草自下向上数第6 片完展叶的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）和水分利用率（WUE）等指标。测定条件：红蓝光源，叶室温度设定为28 ℃，气体流量500 μmol·s-1，CO2浓度变化范围为377～400 μmol·mol-1。光合有效辐射（PAR）分别设置为1 000、1 300 和1 500 μmol·m-2·s-1，再按照设定要求从PAR 值由高至低的顺序进行测定，绘制PAR光合响应曲线，每株烟样重复测定3 次，取3 次重复的平均值。

1.2.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2003 及SPSS 16.0 软件进行数据处理，数据均表示为平均值±标准差（SD）。采用统计方法中独立样本T 检验，测定各组间差异的显著性。

2 结果与讨论

2.1 转基因烟草的鉴定

对3～5 叶期T2代转基因烟草植株GUS 染色和PCR 扩增检测，共筛选获得转基因烟草植株38 株，其中Q1 株系13 株、Q2 株系10 株和Q3 株系15 株，见图2。另外，对团棵期的3 个独立转基因株系和非转基因株系的农艺性状指标调查发现，株高、叶片数等农艺指标均无明显差异。

Q1、Q2、Q3.不同的转基因株系；TP、WT.分别为转基因和野生型植株；M.DL 2000 DNA marker；P.阳性对照；N.阴性对照；A.不同烟草植株生长表型；B.烟草植株的GUS 染色图；C.转基因烟草的PCR 鉴定图

2.2 TMV 接种对转基因烟草NrCN 表达的影响

TMV 接种转基因3 个烟草株系（Q1、Q2 和Q3）后，烟草植株接种叶片均形成抗病坏死斑，而非转基因植株未见坏死斑形成。推测NrCN 的导入诱导了转基因烟草产生免疫应答反应，进而通过坏死斑的形成而抑制TMV 的扩散。这与前人对野生型黏烟草（N.glutinosa）中TMV 抗性N 基因介导的抗病作用机制的研究结果相似，即TMV 的侵入引起了N 基因表达量的显著上调［13］。通过接种试验发现，接种第5 天时Q2 植株出现的坏死斑最多，Q1 植株次之（图3A）。进一步对NrCN 基因的qRT-PCR 分析表明，接种前非转基因和转基因烟草均有NrCN 的表达，但该基因在两种植株中表达量均较低，随着接种后时间的推进，Q1、Q2 和Q3 植株中NrCN 基因表达量有不同程度增加，其中以Q2 株系中NrCN 表达量最高（扩增条带最亮）。非转基因烟草接种前后均检测到NrCN 基因的表达，推测非转基因烟草中可能存在与NrCN基因同源且无抗病功能的基因（图3B 和3C）。推测Q2 株系形成较多数量的坏死斑可能与NrCN 在Q2 株系中的多拷贝有关，而基因拷贝数与其表达量间存在一定的联系。Li 等［29］研究发现，短日生长豌豆（Pisum sativum）花后特异基因PPF1在转基因水稻中存在多拷贝，可引起PPF1基因表达受到抑制，拷贝数与基因表达量表现出负向相关。而本研究中多拷贝的NrCN 出现了高表达量，两者又表现为正向相关，这可能是由于外源基因在宿主染色体插入位点不同或是由于这些基因的启动子受特异因子调控启动引起的表达差异造成的。

图3 烟草植株接种TMV 表型比较及NrCN 基因表达量分析Fig.3 Phenotype and NrCN expression levels of transgenic tobacco inoculated TMV

2.3 NrCN 基因对转基因烟草化学成分的影响

由图4 可以看出，除Q1 株系外，打顶前转基因Q2 和Q3 株系的总植物碱（以烟碱计）和总氮含量均显著低于非转基因植株。打顶引起了所有烟草植株的总植物碱积累量增加，其中以Q1株系增幅最大，为59.5%，Q3 株系次之，为28.7%，Q2 株系最低，为18.2%（图4A）。尽管打顶增加了烟株总植物碱的积累量，但Q2 和Q3 株系打顶后其总植物碱含量仍显著低于非转基因烟草。打顶前，转基因株系Q2 和Q3 的总氮含量也显著低于非转基因植株和Q1 株系，打顶后各植株的总氮含量均有不同程度下降，Q1 株系总氮含量高于非转基因植株12.6%，Q2 株系总氮含量低于非转基因植株7.6%（图4B），说明不同转基因植株在应答打顶处理时调节总氮含量的能力存在一定差异。其中Q2 株系推测可能是由于多拷贝基因的插入破坏了植物碱合成的相关基因，最终导致了总植物碱含量显著下降。打顶未显著增加总植物碱的积累量，这暗示着Q2 株系中总植物碱合成受到了一定抑制。同样，打顶也引起各烟草株系中钾离子含量下降，打顶后除Q1 株系钾离子含量显著高于非转基因植株外，其余2 个转基因株系中钾离子含量与非转基因植株无显著差异（图4C）；在烟株打顶前后，转基因Q2 株系的氯离子含量均显著高于Q1、Q3和非转基因植株，且打顶引起的氯离子含量降幅最小，仅为非转基因植株的7.58%（图4D），说明NrCN 基因的多拷贝还导致了Q2 株系中Cl-含量提高，而过高的氯离子含量又会影响烟叶的品质［30］。不同烟草株系可溶性糖含量的测定结果（图5）表明，除Q3 株系外，Q1 和Q2 株系可溶性糖含量分别表现为显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）高于非转基因植株（14.82 mg·g-1），分别为21.88 和16.85 mg·g-1。

图4 NrCN 基因对烟草烟叶化学成分的影响Fig.4 Effects of NrCN on tobacco leaf chemical compositions

图5 打顶前不同烟草株系可溶性糖含量的比较Fig.5 Soluble sugar contents in different tobacco plants before topping

2.4 转基因植株光合作用指标

图6 打顶前不同烟草株系光合特征指标的比较Fig.6 Photosynthetic indexes in different tobacco plants before topping

各烟草株系在一定光强范围（1 000～1 500 μmol·m-2·s-1）内的光合特征指标测定结果（图6）表明，Q2 株系的Pn 值显著低于Q1、Q3 和非转基因株系。低光强时（1 000 μmol·m-2·s-1）Q1 株系和非转基因植株Pn 值相当，均显著高于Q3 株系；当光强增加至1 300 μmol·m-2·s-1时，Q1、Q3和非转基因植株的Pn 值差异不显著；但当光强增加到1 500 μmol·m-2·s-1时，非转基因植株的Pn值显著高于转基因植株（图6A）。在光强1 000～1 500 μmol·m-2·s-1范围内，Q2 株系的气孔导度值显著低于其他3 个株系，且非转基因株系的Gs 值在光强为1 000、1 300 和1 500 μmol·m-2·s-1时均显著高于Q1 株系；除在光强1 300 μmol·m-2·s-1时Q3 株系Gs 值显著高于非转基因植株外，低光强（1 000 μmol·m-2·s-1）和高光强（1 500 μmol·m-2·s-1）均低于非转基因植株，差异达到显著水平（图6B）。同样，光照强度在1 000～1 500 μmol·m-2·s-1范围时，Q2 株系的蒸腾速率值也显著低于其他3个株系。在低光照强度（1 000 μmol·m-2·s-1）时，Q1 株系的蒸腾速率最高，为2.5 μmolH2O·m-2·s-1；非转基因株系次之，为2.5 μmolH2O·m-2·s-1；Q2 株系最低，为0.7 μmolH2O·m-2·s-1。随着光照强度的增加，除Q1 株系的Tr 值下降外，Q2、Q3 和非转基因株系的Tr 值均增加，后两者的蒸腾速率值始终高于前者，差异达到显著水平（图6C）。因此，在设定光强范围（1 000～1 500 μmol·m2·s-1）内Q2株系中的多拷贝NrCN 基因导致植株Pn、Gs 和Tr的显著下降，推测导致这一现象的原因可能是由于过量NrCN 基因表达引起CN 蛋白的显著积累。而后者作为免疫应答的重要组分，若含量过高时可能会引起转基因植株长期处于一种免疫应答的应激状态，转基因植株势必会通过下调光合作用以消除由免疫应激引起的高强代谢水平，进而调节植株的生理平衡。在本试验光照强度范围内，WUE 指标在Q2 株系中显著高于转基因Q1、Q3 和非转基因株系。当光照强度达1 500 μmol·m2·s-1时，转基因植株的WUE 均显著高于非转基因植株，说明光照强度高时，NrCN 基因的导入又可通过提高转基因植株对水分的利用来平衡植物体的光合效率。也说明不同转基因株系在应答不同光照强度诱发的光合作用时，由于外源基因拷贝数及插入染色体位置不同，使不同转基因植株表现出光合特征指标变化方面的差异。此外，有研究表明，植株中K+含量与光合作用也存在一定的关系，转基因烟株钾含量积累能力的差异可能也会引起各转基因植株光合特征指标的改变［31-32］。

可见，Q2 株系比Q1 和Q3 株系的抗病性强且综合品质较好，但鉴于前期研究结果表明该株系为多拷贝转基因植株，不利于作为亲本材料进行育种试验。因此，结合抗病性和烟叶品质分析结果，确定Q1 株系作为亲本材料更有利于培育抗TMV 且烟叶品质优良的种质或品种。

3 结论

以含TMV 抗性NrCN 基因的烟草为材料，在人工培养箱和温室条件下的试验结果表明，转基因烟草均能较好地应答TMV 感染，且对不同株系品质的影响存在一定差异。其中转基因Q1 株系（含单拷贝抗病NrCN 基因）与非转基因野生型栽

培烟草相比，烟草抗病性显著提高，烟叶总植物碱、总氮及钾离子含量等化学成分指标均达到或高于非转基因野生型栽培烟草。另外，Q1 株系在低光强（1 000 μmol·m2·s-1）时其Pn、Gs 和Tr 值均显著提高，但随着光强的增强这3 个光合作用指标值又逐渐降低，说明低光照强度即可满足Q1株系的光合作用。因此，Q1 转基因烟草株系可作为培育抗病优质烟草新种质或新品种的理想亲本材料。