田永峰，李 鹏，刘 泽，孙世豪，董高峰，张 杰，王昆淼，段沅杏，汤建国，杨 柳，杨 继，陈永宽，缪明明，刘志华*

1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明市五华区红锦路367 号 650231

2.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

3.上海烟草集团有限责任公司北京卷烟厂，北京市通州区万盛南街99 号 100024

口含烟包括嚼烟（chewing tobacco）、瑞典含烟（snus）、美式含烟（moist snuff）、烟草膏（tobacco paste）、牙 粉（tooth powder）、可 溶 烟 草 片（dissolvable tobacco）等，目前主要的市售产品为瑞典含烟和美式含烟［1-3］。口含烟最早出现于17 世纪，1730 年美国成立了口含烟加工厂，1822 年第一个口含烟品牌“Ettan”诞生于瑞典［1］。口含烟由于无须燃烧、不产生烟气，因此具有使用场所不受限制的特点。随着全球控烟形势的日趋严峻，口含烟因其独特的使用方式而成为解决公共场所吸烟和消除环境影响的有效解决方案，并成为各国烟草公司的研究重点之一［2］。口含烟使用时，将其放入唇部和牙龈之间，烟碱经口腔黏膜吸收后进入血液，进而使消费者获得生理满足感。因此，使用口腔模拟装置研究口含烟中烟碱释放的影响因素对于该类产品的配方开发、工艺优化及质量评价具有重要意义［3］。张杰等［4-5］使用一种模拟装置分析了无烟气烟草制品的烟碱体外释放特征；张文娟等［6］对上述模拟装置进行了改进，并研究了胶基型无烟气烟草制品中烟碱的释放行为；李鹏等［7］考察了行业标准方法在测试口含烟化学指标中的适用性；段沅杏等［8］测定了口用型无烟气烟草制品中的烟碱含量。目前，口含烟相关研究中主要参考行业标准方法中的前处理方法及色谱质谱检测条件，针对口含烟分析装置及方法的报道较少，烟碱释放的影响因素研究也不够深入、全面。为此，本研究中使用自主研发的能够模拟唇齿之间挤压力的口腔模拟溶出装置，考察口含烟含水率、烟粉粒径和pH 对口含烟烟碱释放率的影响，旨在为口含烟的质量评价及烟碱释放调控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

不同含水率、烟粉粒径和pH 的Showker Mint系列口含烟样品，由云南中烟工业有限责任公司根 据Swedish Match GothiaTek®standard［9］制 备。样品含水率分别为11%、32%和51%，烟粉粒径分别为180 μm（10 目）、380 μm（40 目）和1 700 μm（80 目），pH 分别6.7、7.5 和8.4。实验前所有样品均密封储存于冰箱中，样品信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Sample information

甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；氯化镁（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；磷酸氢二钾（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；苯甲酸钠、山梨酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氯化钠、氯化钙、氯化钾（分析纯，西陇化工股份有限公司）；实验中所用3 种人工唾液［10］的配方见表2。

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；口腔模拟溶出装置［11］（云南中烟工业有限责任公司研发）；BT100-02 恒流泵（保定齐力恒流泵有限公司）；PHS.3C 型pH 计（上海精密科学仪器有限公司）；Milli-Q50 超纯水仪（美国Millipore 公司）；CP2245 型电子天平（感量：0.000 1 g，德国Sartorius 公司）。

表2 人工唾液配方组成Tab.2 Artificial saliva formulation

1.2 方法

1.2.1 口腔模拟溶出装置组成

口腔模拟溶出装置见图1。该装置主要包括集液器（1）、模拟溶出主机（3）、两台相同规格的蠕动泵（2、4）、模拟口腔组件（5）、砝码组件（6）和唾液采集盘（9）。其中模拟溶出主机（3）由挤压机械手（7）和模拟口腔（8）组成。

1.2.2 口腔模拟溶出装置工作原理

图1 体外烟碱溶出口腔模拟装置示意图Fig.1 Schematic diagram of a buccal cavity simulator for in vitro release of nicotine

图2 体外烟碱溶出口腔模拟装置工作原理示意图Fig.2 Schematic diagram of working principle of buccal cavity simulator for in vitro release of nicotine

如图2 所示，该装置通过步进电机驱动口腔模拟组件往复运动并结合磁力控制最终实现口腔开合动作，通过配合不同质量砝码搭配可实现不同挤压力设定，通过蠕动泵可实现唾液流量调整。模拟口腔包括溶液皿和开合导向槽。其中，溶液皿具有进液管和出液管；开合导向槽则位于溶液皿内部，具有一对夹合组件。夹合组件包括唇板、固定在唇板上的夹板及位于夹板底部的电磁铁，通过调节磁力可实现模拟口腔的开合。模拟口腔的溶液皿用于放置样品和人工唾液，溶液皿底部适配加热板及加热管，用于保持溶液皿内的恒温环境。通过设置开合导向槽的开合度可实现模拟口含烟使用过程中的口腔环境，挤压机械手的上下移动可实现模拟唇部对口含烟的挤压动作。

实验中，将人工唾液泵入储液瓶中，并置于恒温槽内保持恒温，由蠕动泵泵入人工唾液。出液管路与集液器相连，该部分包含15 工位（14 个10 mL 试剂瓶和1 个废液排出管）唾液采集盘、旋转驱动步进电机（闭环控制）、驱动同步轮和同步带及支架主体。该装置由电脑控制，除具有咀嚼功能外，还具有唇部蠕动、唾液自动定量收集等功能，可以实现样品的自动挤压和溶出液的实时在线采集。

1.2.3 口含烟烟碱体外溶出实验

将人工唾液加入储液瓶中，置于37 ℃水浴锅内；开启蠕动泵，待系统稳定至37 ℃后，设定模拟溶出装置参数；将口含烟样品放入溶液皿内并开始计时，分别在2、4、6、8、10、15、20、25、30 min 时收集人工唾液，每次收集后立即检测人工唾液中烟碱含量；收集人工唾液30 min 后，取出口含烟残留样品，置于50 mL 三角瓶中备用。

1.2.4 烟碱释放率检测

利用高效液相色谱仪检测样品中的烟碱。色谱柱：Waters XTerra C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：甲醇，B：20 mmol 的磷酸盐缓冲溶液（0.2%三乙胺，pH 6.0），A∶B 为18∶82；流动相流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃。

1.2.5 烟碱释放率分析

将口含烟残留样品的小袋剪开并连同小袋一起放入50 mL 三角瓶中；加入20 mL 乙醇与5%NaOH溶液（体积比9∶1）的混合溶液，超声萃取30 min；将烟碱人工唾液和残留样品萃取液分别过0.45 μm滤膜后，采用HPLC 进行定量检测；根据定量结果计算烟碱累计释放率，并绘制烟碱释放曲线。烟碱累计释放率由一段时间的烟碱释放量除以样品总烟碱量计算，其中样品总烟碱量为样品30 min的烟碱释放量与残留样品中烟碱量的总和。

1.2.6 数据处理

采用SPSS 17.0 软件对烟碱释放结果进行t 检验，取显著水平0.05，定量结果以均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 口含烟烟碱口腔模拟溶出检测方法评价

2.1.1 检出限和定量限

取pH 5.2 的人工唾液分别配制质量浓度为5、20、50、100、200、400、600、1 000 μg/mL 的烟碱标准溶液，采用HPLC 进行分析，每个样品重复3 次并取平均值，以烟碱质量浓度（x，μg/mL）对烟碱峰面积（y）进行线性回归分析，得到烟碱的标准工作曲线为y=10.60 x-11.72，R2=0.999 9。分别以3倍和10 倍信噪比计算方法的检出限和定量限，分别为3.9 和13.0 μg/g。

2.1.2 精密度和回收率

取口含烟样品Showker Mint（1#），分别按照低、中、高3 种水平加入烟碱标准品，每个添加水平均重复5 次。将加标样品按优化的方法进行前处理，连续测定6 d。方法的精密度和回收率结果见表3。可以看出，方法的日内精密度为0.87%～3.35%，日间精密度为3.52%～4.91%，加标回收率94.2%～98.5%，表明本方法可以满足定量要求。

表3 方法精密度与回收率Tab.3 Recovery and precision of the method

2.2 人工唾液使用条件的确定

使用表2 所示的人工唾液配方测定口含烟烟碱释放率，结果显示，在3 种人工唾液中口含烟烟碱的释放率均超过99%，可以满足实验要求。烟碱在酸性条件下呈质子化形态分布，碱性条件下向游离态转化，为使烟碱更快速地溶解在人工唾液中，本研究中选择3#人工唾液。据文献［12］报道，人体在未接受刺激的条件下，唾液分泌速度约为0.06～1.8 mL/min，而在强烈刺激条件下，唾液的分泌速度会增加。鉴于口含烟烟碱会对使用者产生刺激，使唾液分泌速度加快，因此本研究中选择人工唾液流速2 mL/min。通常，人体口腔温度在36.3～37.2 ℃之间，国内外口含制剂溶出度测定中通常选择37 ℃，因此，本研究中通过恒温槽、加热线圈、温度传感器使实验体系维持在（37.0±0.1）℃。

2.3 口含烟品质影响因素分析

2.3.1 含水率对口含烟烟碱释放率的影响

国际市场市售无烟气烟草制品的含水率在8%～55%之间［13-15］，因此制备了含水率分别为11%、32%、51%的样品进行分析。每种样品取3 个平行，按1.2 节方法进行口含烟烟碱释放实验，烟碱释放率如图3 所示。可以看出，含水率对烟碱释放有一定的影响，含水率高的样品在初始2 min的烟碱释放率提高约40%。在烟草物料中，烟碱的释放需先经历吸收水分溶出的过程，因此口含烟样品接触人工唾液后，烟碱的释放存在一定的滞后，此过程约为20～50 s。含水率低的样品吸水过程时间长，其烟碱释放较慢。本研究中，3 个不同含水率样品在使用30 min 后其烟碱释放率均超过95%，说明含水率较高时，不同样品的烟碱释放行为差异较小。

图3 不同含水率口含烟烟碱释放率Fig.3 Release rates of nicotine from snus with different moisture contents

2.3.2 pH 对烟碱释放的影响

通常，无烟气烟草制品的pH 在6.0～8.5 之间［16-17］，因 此 制 备 了pH 分别为6.7、7.5 和8.4 的样品进行分析。每种样品取3 个平行，按1.2 节方法进行口含烟烟碱释放实验，烟碱释放率如图4所示。可以看出，不同pH 口含烟的烟碱释放速率具有显著差异（P＜0.05）。3 种不同pH 样品烟碱释放率随样品pH 的增大而减小，这是由于烟碱在碱性条件下主要以游离态存在，相反则主要以质子化形态存在，质子化的烟碱更易溶于水中，因此，与pH 高的样品相比，pH 低的样品中烟碱释放率更快。

图4 不同pH 口含烟烟碱释放率Fig.4 Release rates of nicotine from snus with different pH values

有研究表明，烟草制品中游离烟碱的含量是影响产品生理满足感的重要因素，其与pH 呈正相关［18-20］。因此，调节pH 是提高烟草制品中游离烟碱含量的有效途径。艾明欢等［21］研究了口含烟原料中游离烟碱与含水率和pH 的关系，结果表明，在相同的游离烟碱变化量下，不同烟草原料pH 变化幅度为1 时对应的含水率变化量为0.4%～1.0%。由于口含烟中含水率可调范围广，因此，与pH 调节法相比，含水率调节是更加有效的口含烟游离烟碱含量调节途径。

2.3.3 烟粉粒径对烟碱释放的影响

图5 不同烟粉粒径烟碱释放率Fig.5 Release rates of nicotine from snus with tobacco powder of different particle sizes

通过对无烟气烟草制品的分析发现，其颗粒分布于10～80 目之间。因此选择10、40 和80 目3个样品进行分析。每组样品取3 个平行，按照1.2节方法进行口含烟烟碱释放实验，烟碱释放率如图5 所示。可以看出，不同烟粉粒径的口含烟烟碱释放速率存在显著差异（P＜0.05），烟碱的释放速率随着烟粉粒径的减小快速增加，80 目样品的烟碱释放率是10 目样品的3 倍。可见，烟粉粒径是调节口含烟制品中烟碱释放率的关键影响因素。原因是，随着烟粉粒径的减小，烟粉与唾液的接触面积增加，进而使烟碱释放加快。实验中发现，烟粉粒径大的样品的烟碱释放较为持久和柔和，而颗粒小的样品在开始的6 min 内其烟碱释放率已超过90%。因此，建议使用烟粉粒径较大的烟草原料制备口含烟，以使烟碱的释放更缓和。

2.4 口含烟品质影响因素模型

含水率、烟粉粒径和pH 对口含烟烟碱释放率的影响符合指数函数，a 和b 为常数。不同影响因素下口含烟的烟碱释放率可由方程（1）计算。其中a 和b 值见表4。不同含水率条件下，随着含水率的升高烟碱释放率呈加快趋势，不同pH 条件下，随着pH 的升高烟碱释放率呈降低趋势。不同烟粉粒径条件下，随着烟粉粒径的减小，烟碱释放率呈增大趋势。上述模拟结果与2.3 中实验结果一致，不同条件下R2均大于0.95，说明该方程拟合效果良好。

表4 不同条件下烟碱的释放率方程参数Tab.4 Fitting equation parameters of release rates of nicotine from snus under different conditions

3 结论

开发了一套新型口腔模拟溶出装置，并通过与高效液相色谱法结合建立了一种参数可控、结果可靠的口含烟烟碱体外模拟溶出研究方法。口含烟中含水率对烟碱的释放时间影响较显著，但含水率超过30%后，烟碱释放速率差异不明显。不同口含烟原料中烟碱在碱性条件下均能快速溶出。口含烟烟粉粒径对烟碱释放率的影响最显著，当烟粉粒径1 700 μm 时，在模拟口腔环境中6 min 内烟碱的释放率已超过90%，而烟粉粒径较大的烟草原料中烟碱的释放在前10 min 内较缓慢。3 个影响因素拟合模型为指数方程，拟合系数R2大于0.95，适用于模拟不同条件影响下口含烟烟碱的释放率。本研究结果可为口含烟的质量评价、烟碱释放调控提供技术支持。