袁 玖，张建忠，杜瑞芳，张 榕，徐文静，代春辉，王春卉，柳 振，杨 帆，万欣杰

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070；2.甘肃正合生物科技有限公司，兰州 730060）

打瓜（seed melon）是常见的经济作物之一。打瓜籽壳是打瓜籽实的副产品，资源丰富，但基本未被有效利用。然而，打瓜籽壳消化率低、适口性差，单独饲喂不能满足动物的营养需要。但这些限制可以通过补饲优质饲料获得正组合效应被克服[1]。混合饲料或日粮的可利用能或消化率不等于混合饲料中各个饲料的可利用能或消化率的加权值，这意味着“组合效应”（associative effects，AE）产生[2-3]。而这些组合效应可以改变反刍动物胃肠道（尤其是瘤胃）的代谢过程。豆科牧草的蛋白质含量高于其他牧草和低质粗饲料，添加苜蓿（Medicago sativa）等豆科牧草可以提高这些低质饲料的利用率[4-6]。F.Tagliapietra等[7]研究表明，将优质牧草（苹果渣、柑橘浆）与低质饲草（皇冠雏菊、奶蓟）配合，低质牧草的体外发酵性能显著提高。另外，饲草基础日粮要想获得理想的生产性能，必须同时配合饲喂精料，精料的补充量取决于基础饲料和动物的特性[8]。A.T.Dolebo 等[9]报道，波尔奶山羊的日粮精料水平和干草来源可作为预测饲粮负AE 的方法，且发现低水平精料和中等水平的生长期杂草能准确预测ME 摄入量。在高精料日粮中，为显著提高生长羔羊的生产性能和饲料效率，需要用玉米代替至少20%（DM 基础）的大麦日粮[10]。

研究饲料AE 的方法有体外发酵试验、体内消化代谢试验和动物饲养试验。由于产气量同有机物消化率高度相关，因此，体外产气试验成为众多学者研究不同饲料间AE 的首选方法[11]。反刍动物饲料间的AE 在精、粗饲料之间最显著，因此，饲粮的精粗比（C∶R）是决定瘤胃发酵特征主要因素之一。王加启等[12]发现，精、粗饲料的负 AE 点为 C∶R 大于70%；当精料比例达到20%～60%时对日粮干物质消失率无显著影响；即使C∶R 完全一致，AE 仍表现很大的不同。国内、外有关饲料组合效应的报道很多，然而，将打瓜籽壳作为饲料，与苜蓿、精料配比后对产气量和瘤胃发酵参数的AE 的影响报道尚未见到。而且，现有饲料组合效应方面的报道，多数是评价单一指标的AE 值或几个单独指标各自的AE，很少进行综合AE 值的评价。因此，本研究的目的旨在用体外产气法评价精粗比40∶60 和 30∶70 下，打瓜籽壳与苜蓿、精料不同配比对各饲粮组合的各单项指标组合效应和综合组合效应的影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料

精料购自兰州联邦饲料有限公司，打瓜籽壳、苜蓿来自甘肃省兰州市。精料、打瓜籽壳、苜蓿通过干燥、粉碎、过1 mm 标准筛。精料补充料的配方（风干基础）：玉米85.17%，豆粕7.22%，棉籽粕3.46%，食盐1.65%，预混料2.50%。

1.2 试验设计

精粗比为 40∶60 和 30∶70，精料（DM 基础）占40%和 30%，打瓜籽壳（DM 基础）、苜蓿（DM 基础）占60%和70%。具体为：精料（Concentrate，C）∶打瓜籽壳（Watermelon seed shell，W）∶苜蓿（Alfalfa，A）分别为 40∶60∶0、40∶45∶15、40∶30∶30、40∶15∶45、40∶0∶60和 30∶70∶0、30∶55∶15、30∶40∶30、30∶25∶45、30∶10∶60、30∶0∶70。3 种单独饲料和 11 种组合，每组设 3 个重复，3 个空白管，共（14×3）+3=45 种饲粮。

1.3 瘤胃液供体动物及其饲养

3 只安装永久性瘤胃瘘管的荷斯坦干奶牛，饲喂的日粮：干草自由采食，精料（配方组成及养分含量见表1）4 kg·天-1·头-1，每日喂 2 次，自由饮水。体外培养试验当日早饲前采集3 只瘘管牛的瘤胃液，经4 层纱布过滤至预热过的保温瓶，连续通入CO2，保证瘤胃液的厌氧环境，迅速转移至实验室，待用。

1.4 体外发酵培养程序

准确称取11 种饲粮组合和3 种单独的饲料（0.200±0.001）g（DM 基础），装入 2.0 cm×3.0 cm 尼龙袋（孔径 50 μm），送入产气管底部，加入预热 39±0.5 ℃的体外发酵培养液30 mL（10 mL 瘤胃液+20 mL 缓冲液，缓冲液参照K.H.Menke[14]方法配制）。迅速排出管内空气，用胶管和夹子密封产气管，记录初始刻度（mL）。将产气管置39 ℃恒温水浴摇床中培养2、4、6、9、12、24、36 和 48 h 时，记录各时间点产气量（gas production，GP）（mL）。

某时间点GP（mL）=该段时间样品GP-产气管初始刻度-该段时间空白管GP。

表1 3 头奶牛试验日粮中精料的组成及营养水平（干物质基础）Table 1 Ingredients and nutrient levels of concentrate of experimental diet for 3 cows (DM basis)

1.5 上清液及残渣的采集

48 h 培养结束后，将尼龙袋迅速放入冰水中，使尼龙袋内样品停止发酵，用流动的蒸馏水将尼龙袋冲洗干净，自然晾干，转移至65 ℃烘箱烘干48 h至恒重后，计算干物质降解率（dry matter digestibility，DMD）。残渣测定粗灰分后，计算有机物降解率（organic matter digestibility，OMD）。

将培养液装入离心管，10 000×g 离心10 min，上清液转至5 mL 离心管，盖紧管口，编号记录，-20 ℃冰柜保存，待测乙酸、丙酸等各种挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）和氨态氮（NH3-N）含量。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 饲料常规营养水平

按常规法AOAC[15]测定打瓜籽壳、苜蓿、精料的干物质（dry matter，DM）、粗蛋白质（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）、粗纤维（crude fiber，CF）和粗灰分（Ash）含量。

1.6.2 产气数据的计算

（1）GP 测定。

GPt=200×（Vt-V0）/W 式中，t 为发酵开始后某一时间（h）；GPt为样品 t 时刻产气量（mL）；200 为产气管内样品的总重量（200 mg）；Vt为样品发酵t h 后产气管读数；V0为样品发酵t h 后空白管读数；W 为样品干物质重（mg）。

（2）产气参数计算。

利用“Fit curve”软件，Orskov 和 McDonald[16]产气模型公式 GP=a+b（l-e-ct），将各样品在 2、4、6、9、12、24、36、48 h 时的 GP 代入，计算消化动力参数。式中，t 为发酵开始后某一时间（h）；a 为快速产气部分（mL）；b 为缓慢产气部分（mL）；c 为 b 的产气速度常数（%·h-1）；a+b 为潜在产气量（mL）。

1.6.3 瘤胃发酵参数、DMD、OMD 的测定

pH 采用梅特勒-托利多FE20 型酸度计测定；NH3-N 浓度采用冯宗慈等[17]比色法测定；VFA 浓度采用岛津GC-2010 气相色谱法测定[18]。DMD、OMD公式：

干物质降解率（DMD，%）=（原样品重量×原DM含量-残渣样品重量×残渣DM 含量）/原样品重量×原DM 含量×100%有机物降解率（OMD，%）=（原样品重量×原OM 含量-残渣样品重量×残渣有机物含量）/原样品重量×原 OM 含量×100%。

1.6.4 组合效应的计算

单项组合效应指数（single-factor associative effects index，SFAEI）和综合组合效应指数（multiplefactors associative effects index，MFAEI）参照王旭[19]方法。

SFAEI=（各组合实测值-加权估算值）×100/加权估算值。式中，实测值为各组合的实际测定值，加权估算值=打瓜籽壳实测值×打瓜籽壳配比+精料实测值×精料配比+苜蓿实测值×苜蓿配比。

MFAEI=∑SFAEI=AEGP48h+AEDMD+AEOMD+AEVFA+AENH3-N。

1.7 数据处理与统计分析

试验数据采用Excel 2013 处理计算后，采用SPSS 16.0 软件包对数据进行单因子方差分析，结果以平均值和平均标准误（SEM）表示，以P＜0.05 为差异显著判断标准，以P＜0.01 为差异极显著判断标准，以0.05≤P＜0.10 为有变化趋势标准。差异显著时，采用Tukey 氏法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 饲料营养水平及产气参数

由表2可见，精料（19.2%）CP 高于苜蓿（18.5%）和打瓜籽壳（3.4%）；打瓜籽壳CF 最高为55.7%，苜蓿和精料分别是29.4%和7.9%；打瓜籽壳EE 为13.3%，高于精料（4.2%）和苜蓿（6.6%）。

打瓜籽壳、精料、苜蓿的快速产气部分a 分别是3.7 mL、-10.5 mL 和-2.9 mL，说明打瓜籽壳产气不滞后，精料产气滞后时间最长，苜蓿次之。缓慢产气部分 b，精料（56.1 mL）高于打瓜籽壳（51.9 mL）和苜蓿（29.6 mL）。b 的产气速度常数c、潜在产气量（a+b）和 48 h 产气量 GP48 h，打瓜籽壳（0.138%·h-1、55.6 mL 和 44.3 mL）高于精料（0.121%·h-1、45.5 mL和 42.5 mL）和苜蓿（0.056%·h-1、26.7 mL 和 15.8 mL）。

表2 饲料营养水平及体外产气参数（风干基础）Table 2 Nutrient levels and in vitro gas parameters of experimental diets (air-dry basis)

2.2 各饲粮组合的产气参数

表3可见，C∶R 为 40∶60 时，打瓜籽壳所占比例为 45、30 和 15 的组（即 40∶45∶15、40∶30∶30 和 40∶15∶45 组，简称“45 组”、“30 组”和“15 组”，下同）的 b、（a+b）和 GP48 h 显著高于 60 和 0 组（P＜0.05）。各组间 a 和 c 无显著差异（P＞0.05）。C∶R 为 30∶70 时，40、25 和 10 组的 a 和 c 显著高于 70、55 和 0 组（P＜0.05）。40、25 和 10 组的 b 极显著高于 70 组（P＜0.01），与55 和 0 组无显著差异（P＞0.05）。40、25 和 10 组的（a+b）极显著高于 70、55 和 0 组（P＜0.01）。25 和 10组的 GP48 h 显著高于 70、55、40 和 0 组（P＜0.05）。

表3 打瓜籽壳与苜蓿、精料体外混合培养48 h 后的产气及发酵参数Table 3 GP and fermentation parameters at 48 h when watermelon seed shell was incubated with alfalfa ＆ concentrate in vitro

2.3 各饲粮组合的瘤胃pH、DMD、OMD、NH3-N和VFA浓度

表3可见，C∶R 为 40∶60 时，60、15 和 0 打瓜籽壳组的瘤胃 pH 显著高于 45 和 30 组（P＜0.05）。45和 30 组的 DMD 和 OMD 显著高于 60、15 和 0 组（P＜0.05）。45、30 和 15 组的 NH3-N 浓度显著高于60 和 0 组（P＜0.05）。C∶R 为 30∶70 时，70、55、40 和 0组瘤胃 pH 显著高于 25 和 10 组（P＜0.05）。40、25 和10 组的 DMD 和 OMD 显著高于 70、55 和 0 组（P＜0.05），55 和 0 组显著高于 70 组（P＜0.05）。25 和 10组 NH3-N 极显著高于 70、55、40 和 0 组（P＜0.01）。

由表4可知，C∶R 为 40∶60 时，45 和 30 组的乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸（TVFA）均显著高于60 和0 组（P＜0.05），与 15 组无显著差异（P＞0.05）。45 和30 组的丁酸、异戊酸显著高于 60、15 和 0 组（P＜0.05）。C∶R 为 30∶70 时，25 和 10 组的乙酸显著高于 70、55和 0 组（P＜0.05），与 40 组无显著差异（P＞0.05）。25和 10 组的丙酸、戊酸显著高于 70、55、40 和 0 组（P＜0.05）。40、25 和 10 组的异丁酸、异戊酸和 TVFA显著高于 70、55 和 0 组（P＜0.05）。其他 VFA 和乙/丙，各组间无显著差异（P＞0.05）。

表4 打瓜籽壳与苜蓿、精料体外混合培养48 h 后的挥发性脂肪酸Table 4 VFA at 48 h when watermelon seed shell was incubated with alfalfa and concentrate in vitro mmol·L-1

2.4 各饲粮组合的SFAEI和MFAEI

表5可见，C∶R 为 40∶60 时，45 和 30 组的 GP48 h的 AE 极显著高于 60、15 和 0 组（P＜0.01），15 组极显著高于 60 和 0 组（P＜0.01）。45 和 30 组的 DMD的 AE 极显著高于 60 和 0 组（P＜0.01），与 15 组差异不显著（P＞0.05）。45 组的 OMD 的 AE 极显著高于 60、30、15 和 0 组（P＜0.01），30 和 15 组极显著高于 60 和 0 组（P＜0.01）。45 和 30 组的 TVFA 的 AE 极显著高于 60、15 和 0 组（P＜0.01）。45 组的 NH3-N 的AE 显著高于 60、30、15 和 0 组（P＜0.05），30、15 和 0组显著高于 60 组（P＜0.05）。45 组（147.76%）和 30 组（119.28%）的 MFAEI 极显著高于 60 组（-14.14%）、15 组（76.16%）和 0 组（31.18%）（P＜0.001），45 组显著高于 30 组（P＜0.05），15 组极显著高于 60 和 0 组（P＜0.01），0 组极显著高于 60 组（P＜0.01）。

C∶R 为 30∶70 时，25 和 10 组的 GP48 h 的 AE极显著高于 70、55、40 和 0 组（P＜0.001），40 组极显著高于 70、55 和 0 组（P＜0.01），0 组极显著高于 70和 55 组（P＜0.01）。25 和 10 组的 DMD 的 AE 极显著高于 70、55、40 和 0 组（P＜0.01）。25 和 10 组的 OMD的 AE 显著高于 70、55、40 和 0 组（P＜0.05），55、40 和0 组显著高于 70 组（P＜0.05）。25 和 10 组的 TVFA的 AE 显著高于 70、55 和 0 组（P＜0.05），与 40 组差异不显著（P＞0.05）。25 和 10 组的 NH3-N 的 AE 显著高于 70、55、40 和 0 组（P＜0.05），40 和 0 组显著高于 70 和 55 组（P＜0.05）。25 组（220.87%）和 10 组（194.55%）的 MFAEI 极显著高于 70 组（-23.33%）、55 组（10.66%）、40 组（106.97%）和 0 组（55.99%）（P＜0.001），25 组显著高于 10 组（P＜0.05），40 组极显著高于 70、55 和 0 组（P＜0.01），0 组极显著高于70 和55 组（P＜0.01）。

表5 打瓜籽壳与苜蓿、精料体外混合培养48 h 后的SFAEI 和MFAEITable 5 SFAEI and MFAEI at 48 h when watermelon seed shell was incubated with alfalfa and concentrate in vitro %

3 讨论

3.1 各种饲料的产气参数

本试验中，在a 值上，打瓜籽壳（3.7 mL）产气不滞后，精料（-10.5 mL）产气滞后时间最长，苜蓿（-2.9 mL）次之。研究表明，玉米比大麦有更长的产气滞后时间[20-21]。在本研究中，玉米占精料的85.17%，因此，本试验中精料有更长的产气滞后时间与前人的研究结果一致。打瓜籽壳的a、c、（a+b）和GP48 h均高于精料和苜蓿，表明三种原料中，打瓜籽壳的产气性能最佳，其次是精料，最后是苜蓿。

3.2 各饲料组合的产气量

本试验结果证实，精料∶打瓜籽壳∶苜蓿为40∶45∶15 和 30∶25∶45 的产气和发酵参数均显著高于其他组。由于产气量是预测饲料在反刍动物瘤胃消化率的重要指标[11]。因此，设计单一、混合饲料进行体外产气试验是研究和确定混合饲料AE 的有用工具。研究发现，饲草树叶与精料体外培养时在产气量上有正AE[22]。小麦秸秆与苜蓿混合在产气参数上有正AE[23]。豆科牧草能提高秸秆的利用率，二者混合使用的优势是多种因素综合作用的结果[24]。M.Laura等[25]发现，以 75∶25 或 25∶75 混合体外培养时，2 种慢速发酵纤维（奶蓟草、纯纤维素）配比3 种快速发酵纤维（无籽番茄、柑橘渣、果胶），GP 显著提高。各种牧草和精料之间的AE 也有大量报道[3]。这些报道与本试验结果一致，打瓜籽壳作为一种废弃物或农副产品，与优质的豆科牧草苜蓿配比后，产生了组合效应。

3.3 各饲料组合的瘤胃pH、TVFA和NH3-N浓度

瘤胃pH 是一个综合反应瘤胃内发酵情况和环境变化的重要指标。瘤胃pH 范围一般为6～7，过高或过低都会引起瘤胃发酵异常。反刍动物瘤胃发酵产生VFA 的原因主要是日粮中碳水化合物的降解，它是瘤胃微生物维持和生长的主要能量来源。TVFA与 GP 之间呈正相关。本试验中，45、30 和 25、10 组的TVFA 和GP 显著高于其他组。乙/丙反映了瘤胃发酵的类型。本试验中，乙/丙均大于3，在瘤胃发酵类型中属于乙酸发酵型，有利于反刍动物乳脂率的提高。TVFA 和pH 之间有显著的相关性，VFA 降低瘤胃的 pH[26]。本试验中，45、30 和 25、10 组的TVFA显著高于其他组，而这些组的pH 最低。当VFA 的产生速度快于瘤胃对其吸收速度时，瘤胃pH 下降。因此，pH 的降低与易发酵碳水化合物的摄入水平呈线性相关[3，27]。B.G.Fieser 等[28]给高羊茅干草补饲玉米比补饲大豆皮在OMD 上产生了负AE，NH3-N 浓度降低，但未影响瘤胃pH、TVFA 浓度和乙/丙。这与G.Copani 等[29]研究结果一致。

NH3-N 浓度是反映饲料在瘤胃中氮代谢、微生物蛋白质合成和蛋白质分解的一个重要指标。维持合适的NH3-N 浓度是保证瘤胃微生物蛋白质合成的前提。瘤胃中适宜的 NH3-N 浓度为 6.3～27.5 mg·dL-1[30]。本试验中，各组的NH3-N 浓度均分布在此范围内，且45、30、15 和 25、10 组的 NH3-N 浓度显著高于其他组。原因是这些组合促进了瘤胃内能量和氨气的同步释放和微生物蛋白的合成[31]。

3.4 各饲料组合的DMD和OMD

GP 与瘤胃微生物的活性及饲料的消化率呈正相关[14]。DMD 和OMD 是衡量饲料营养价值和有机物可利用性的重要指标。本试验中，随着精料比例的降低（C∶R 由 40∶60 变为 30∶70 时），需要更少比例的打瓜籽壳（由 45、30 变为 25、10）或者更多比例的苜蓿（由 15、30 变为 45、60）才能取得最佳正 AE，即用优质的苜蓿弥补了精料的降低。原因是苜蓿具有相对高的有效降解率，苜蓿的碳氮比（C/N）更有利于微生物的生长繁殖[32]，而且打瓜籽壳的产气性能较好，优于精料和苜蓿。40∶45∶15、40∶30∶30 和 30∶25∶45、30∶10∶60 各组合饲粮的 DMD 和 OMD 显著增高，原因是这几个饲粮组合中非结构性碳水化合物含量增加，微生物易降解的营养成分增多。据报道，苜蓿日粮中瘤胃真菌孢子的数量显著增加[33]。豆科植物可通过促进纤维素分解菌的生长来增加瘤胃纤维的消化率[34]。用苜蓿补饲劣质饲料对饲料消化率、利用率、采食量AE 的报道很多[25]。用体外发酵法研究苜蓿添加到低质牧草中在产气量[35]、干物质采食量和NDF 消化率[36-37]、动物日增重[38]上均产生了正AE。Wang D.L.等[39]报道，给玉米秸秆日粮每天每只羊补饲苜蓿150～300 g 对小尾寒羊的采食量、饲料消化率、氮代谢、瘤胃环境和血液学参数均产生了最佳AE。随着在泌乳奶牛苜蓿牧草基础日粮中粉碎小麦比例的增加，瘤胃的pH 和日粮纤维消化率逐步下降[40]。将红三叶草和基库尤牧草青贮混合体外培养时，在OMD 上产生了正AE[41]。本试验结果与上述报道相一致。

将春季牧草与玉米混合培养时，在GP、DMD、OMD、OMED 上产生了正AE，而秋季牧草与玉米或大麦混合培养时均产生了正AE[21]。将青干草和全燕麦不同配比饲喂马，随着燕麦比例的增加，饲料DM、OM 和能量消化率呈曲线形上升[42]。枣椰树叶、三芒草属尖刺、黄芪属植物混合喂羊发现，随着枣椰树叶的增加，IVOMD 线性降低[43]。在稻草基础日粮中补饲玉米淀粉饲喂羔羊发现，高水平的淀粉降低了纤维素酶活性、纤维素分解菌群数量和饲料的消化率；适量的淀粉提高了羔羊的生长性能[44]。Niderkorn V.等[45]报道，鲜白三叶与黑麦草的配比为0.25～0.50时，动物的采食量和饲料消化率最优。2 种禾本科（鸭茅、黑麦草）与4 种豆科（紫花苜蓿、白三叶、红三叶、红豆草）牧草1∶1 混合体外培养发现，除了红豆草外，其他3 种豆科牧草与禾本科牧草配比后均产生了正AE[46]。上述报道表明，添加苜蓿可改善低质粗饲料的利用率，这与本试验中45、30 和25、10打瓜籽壳组中苜蓿改善打瓜籽壳的利用率相一致。

3.5 各饲料组合的组合效应值

单项组合效应指数（SFAEI）能在某一个指标上评价饲料的AE。因为AE 机制的复杂性，仅从某一个指标来判断，缺乏代表性[47]，易造成评价不准确。因此，单独用GP 指标评定饲料的营养价值可能不准确。饲料营养价值的评价应采用综合指标或数学模型进行全面、科学的评价。卢德勋[48]根据人工瘤胃GP 法不同时间点测定的各项指标，提出了饲料AE 综合评价指标体系——综合组合效应指数（MFAEI）。韩肖敏等[49]研究发现，玉米秸秆∶稻草为 60∶40、玉米秸秆∶稻草∶玉米秸秆青贮为 24∶16∶60、玉米秸秆∶稻草∶玉米秸秆青贮∶精料为 9.6∶6.4∶24∶60 的 MFAEI 最优。AE 指标包括动物的养分消化率、利用率、能量、生长性能和采食量。体外 GP 与 DOM 有高度相关性[11，50-52]。利用体外发酵GP 法评价饲料AE 的报道很多[53-56]。本试验通过体外发酵GP 法评价打瓜籽壳、苜蓿和精料之间的 AE，是结合 GP、DMD、OMD、VFA、NH3-N等指标进行多因素综合评价后得出，45 和25 组的MFAEI 最优，可能是由于这两组不同比例饲料配比后营养物质间的相互补充，提高了底物的发酵速率，促进了饲料的消化率，即产生了正AE。综上所述，精料∶打瓜籽壳∶苜蓿为 40∶45∶15 和 30∶25∶45 组，能有效改善产气特性和瘤胃发酵48 h 后的饲料利用率。因此，将打瓜籽壳作为反刍动物饲料，可节约常规饲料资源，减轻环境污染，缓解人畜争粮矛盾。

4 结论

当精料∶打瓜籽壳∶苜蓿为 40∶45∶15 和 30∶25∶45时，有最佳的 SFAEI（GP、DMD、OMD、NH3-N、TVFA的AE）和MFAEI。生产实践中，打瓜籽壳可以作为奶牛的饲料饲喂，当 C∶R 为 40∶60 时，打瓜籽壳∶苜蓿按 45∶15 配比；当 C∶R 为 30∶70 时，打瓜籽壳∶苜蓿按 25∶45 配比。