毛晶晶，李泽娇，赵雨晴，袁 澍，袁 明*

（1.四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625014；2.四川农业大学资源学院，成都 611130）

在黑暗或光照条件下，被子植物原质体发育形成黄化质体的过程称为暗形态建成（skotomorphogenesis）或黄化作用；相反，在光照条件下植物幼苗前质体或黄化质体发育成叶绿体的过程称为光形态建成（photomorphogenesis）[1-2]。转绿（greening）就是指植物幼苗从暗形态建成向光形态建成转变的过程[3-4]，叶绿素合成是该过程中最重要的生理生化反应[1-2]。

叶绿素 a（chlorophyll a，Chl a）和叶绿素 b（chlorophyll b，Chl b）在光合作用中的功能是捕获光能并驱动电子转移[5]，对植物的生长发育及作物产量具有极其重要的作用。植物叶绿素生物合成是一个复杂且高度有序的过程，主要包括3 个部分：四吡咯代谢共同途径、镁分支途径和叶绿素循环途径[5]。四吡咯代谢共同途径中间产物包括：δ-氨基乙酰丙酸（δ-aminolevulinic acid，ALA）、单卟啉胆色素原（porphobilinogen，PBG）、尿卟啉原Ⅲ（uroporphyrinogen Ⅲ，Urogen Ⅲ）、粪卟啉原Ⅲ（coproporphyrinogenⅢ，Coprogen Ⅲ）、原卟啉原Ⅸ（protoporphyrinogen，Protogen Ⅸ）和原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ，ProtoⅨ）[5]；镁分支途径中的中间产物包括：Mg-原卟啉Ⅸ（Mg-protoporphyrin Ⅸ，Mg-proto Ⅸ）、Mg-原卟啉甲酯（Mg-protoporphyrin methyl ester，Mpe）、Mg-原卟啉Ⅸ二酯（Mg-protoporphyrin Ⅸ dimethyl ester，Mpde）、原叶绿素酸酯 a（protochlorophyllide，Pchlide a）和叶绿素酸酯 a（chlorophyllide a，Chlide a）[5]；叶绿素循环主要包括Chl a 和Chl b[5]。Proto Ⅸ处还分出另一条合成亚铁血红素（heme）和光敏色素的途径[6]。叶绿素生物合成过程易受外界环境影响，温度就是重要影响因子之一，低温可能导致合成过程中的某些关键酶活性降低甚至丧失，阻碍叶绿素合成和叶绿体发育，导致植物生长迟缓、发育不良甚至死亡[7]。

玉米[8]、黄瓜[9-10]、小麦[10]、青松[11]、水稻[12]等植物在去黄化过程中，盐胁迫、水分胁迫、干旱胁迫、低温或高温胁迫均可下调叶绿素代谢相关基因的表达或影响一些酶的翻译后修饰，导致叶绿素合成的相关酶活性均下降，影响叶绿素合成的前体物质ALA、Mpe、Pchlide 含量，导致叶绿素含量降低，影响植物的代谢、生长、光合作用以及产量[12]。玉米（Zea mays L.）是喜温的禾本科一年生C4 植物，是全世界种植面积最大的作物种类之一，是重要的粮食作物、饲用作物和工业原料作物，在我国农业乃至国民经济中占有重要地位[13]。玉米最适生长温度介于25 ℃到28 ℃之间，在早春播种的玉米经常遭受春季低温（10～18 ℃）胁迫，种子萌发和幼苗生长均受到影响，甚至造成大面积缺苗，最终显著降低产量[13]。因此，研究低温对玉米转绿过程中叶绿素合成的影响具有重要的理论意义和应用价值。

本研究通过对14 ℃（取10～18 ℃中间值）低温胁迫下玉米幼苗转绿过程中叶绿素合成中间产物的分析，探究转绿过程中低温影响叶绿素合成的具体步骤，为进一步探讨低温胁迫调控高等植物叶绿素合成的机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料及处理方法

玉米种子福玉一号购于种衍种业股份有限公司。挑选颗粒饱满完整的玉米种子，用蒸馏水浸种8 h 后，于25 ℃黑暗下催芽48 h。将发芽的种子移栽至土壤（营养土∶黏土=1 ∶1）中在黑暗下培养6 d。将所有的植株随机平均分为两组，每组36 株。一组置于玉米最适生长温度25 ℃，人工光照120 μmol/（m2·s）见光48 h；另一组置于低温胁迫14 ℃，人工光照120 μmol/（m2·s）见光48 h。分别测定见光前、25 ℃见光48 h 和14 ℃见光48 h 植株的第二片叶叶绿素合成途径11 项中间产物及血红素共12 项指标。

1.2 研究指标与方法

1.2.1 叶绿素及血红素含量测定

叶绿素含量测定参照Guo X.等[14]的方法，采用80%丙酮提取色素，并用紫外分光光度计测定叶绿素总量、叶绿素a、叶绿素b 及其比值。血红素含量测定参照O.Czamacki[15]等的方法，采用丙酮-二甲亚砜-浓盐酸，乙醚萃取，紫外分光光度计测定。

1.2.2 叶绿素前体物质含量测定

δ-氨基乙酰丙酸含量测定参照杨清等[16]的方法，4%三氯乙酸提取，Ehrlich-Hg 试剂显色，紫外分光光度计法测定。胆色素原含量测定参照陈凌艳等[17]的方法，采用Tris-EDTA 缓冲液提取，Ehrlich-Hg 试剂显色，紫外分光光度计法测定。尿卟啉原Ⅲ和粪卟啉Ⅲ含量测定参照董立花等[18]的方法，尿卟啉原Ⅲ采用磷酸缓冲液（pH 6.8）提取，紫外分光光度计法测定；粪卟啉Ⅲ采用磷酸缓冲液（pH 6.8）提取，0.1 mol/L 的盐酸萃取，紫外分光光度计法测定。原卟啉Ⅸ含量测定参照舒华等[19]的方法，采用丙酮-氨水混合液提取，正己烷萃取，荧光分光光度计法测定。

镁原卟啉Ⅸ、镁原卟啉Ⅸ单甲酯和镁原卟啉Ⅸ二酯含量测定参照舒华等[19]的方法，采用丙酮-氨水混合液提取，正己烷萃取，Mg-Proto Ⅸ和Mpe 存在于下相丙酮液中，荧光分光光度计法测定Mg-ProtoⅨ和Mpe 的共同荧光强度；采用丙酮-氨水混合液提取，正己烷、乙醚分别依次萃取，从而计算出Mpe的相对含量；Mpde 存在于上述步骤烷相中，将烷相在真空低温干燥箱中干燥后溶于80%丙酮，荧光分光光度计法测定其相对含量。原叶绿素酸酯和叶绿素酸酯含量测定参照董立花等[18]的方法，荧光分光光度计测定相应的荧光强度。

1.3 数据分析

所有试验均重复3 次，试验数据用Excel 2007 整理，用 SPSS 19.0 进行 LSD 显著性差异分析（P＜0.05），用Origin Pro 9.0 进行数据绘图。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对四吡咯代谢共同途径的影响

与未见光相比，见光 48 h 后，25 ℃下 ALA 含量显著下降，但是14 ℃低温下ALA 含量却略有上升（图1），说明光照和温度都是影响ALA 含量的重要因子。见光 48 h 后，PBG、Urogen Ⅲ和 CoprogeⅢ的积累量均升高；14 ℃低温处理的幼苗的PBG、Urogen Ⅲ和Coproge Ⅲ含量均低于25 ℃处理组；说明低温抑制见光幼苗的PBG、Urogen Ⅲ和CoprogeⅢ的积累。Proto Ⅸ是叶绿素和血红素生物合成的最后一个共同中间产物，见光48 h 后，Proto Ⅸ含量均显著下降，尤其是14 ℃低温条件下。与常温转绿相比，低温转绿过程中ALA 积累较高，而PBG、UrogenⅢ、Coproge Ⅲ和Proto Ⅸ含量均低于常温，说明ALA 向PBG 的转化可能受到低温抑制。

2.2 低温胁迫对镁分支途径的影响

光照48 h 后，Mg-proto Ⅸ和Mpe 含量均上升，但是14 ℃低温胁迫下Mg-proto Ⅸ积累量较25 ℃更高，而Mpe 含量较25 ℃低（图2），说明低温可能抑制Mg-proto Ⅸ向Mpe 进一步转化。见光后Mpde 含量均显著下降，且14 ℃和25 ℃处理组无显著差异。Pchlide 和Chlide 见光后含量均显著下降，在14 ℃低温胁迫下更低。低温胁迫可能抑制镁分支途径的Mg-proto Ⅸ向Mpe 的转化，从而导致后续产物Pchlide 和 Chlide 含量较 25 ℃更低。

2.3 低温胁迫对叶绿素合成的影响

25 ℃常温见光后，总叶绿素及叶绿素a、b 含量均急剧上升（图3A）；但14 ℃低温见光后，叶绿素含量与见光前相比变化不显著，表明14 ℃低温严重抑制叶绿素合成。25 ℃和14 ℃见光后的Chl a/Chl b 值分别为4.36 和1.99（图3B），说明低温可能对叶绿素a 向叶绿素b 的转化也有抑制作用。

图1 低温胁迫对四吡咯代谢共同途径中各个中间代谢物相对含量的影响Figure 1 Effect of low temperature on the relative contents of intermediate metabolites in the common pathway of tetrapyrrole metabolism

图2 低温胁迫对镁分支途径中各个中间代谢产物相对含量的影响Figure 2 Effect of low temperature on the relative content of intermediate metabolites in magnesium branching pathway

图3 低温胁迫对总叶绿素和叶绿素a、b 的相对含量（A）以及叶绿素a 与叶绿素b 比值的影响（B）Figure 3 Effect of low temperature on the relative content of total chlorophyll，chlorophyll a，chlorophyll b （A） and the ratio of chlorophyll a to chlorophyll b （B）

2.4 低温胁迫对血红素合成的影响

血红素与叶绿素合成有四吡咯代谢共同途径，共用ALA 前体物质，且血红素对ALA 的合成有反馈抑制作用[6]。本研究表明血红素作为铁分支的第一个产物，见光后，其积累量显著上升，说明光能促进血红素的合成。14 ℃低温下血红素积累量明显低于25 ℃常温下的积累量，说明低温会抑制血红素积累（图4）。

图4 低温胁迫对血红素相对含量的影响Figure 4 The effects of low temperature on on the relative content of heme

3 讨论与结论

目前研究均表明光和温度是影响叶绿素合成的重要环境因素。喻敏等发现低温抑制叶绿素合成，导致其含量显著降低[20]；另外，贾学静在红花木的研究中，认为温度升高可能是红花 檵木红叶转绿的关键因素，再次说明温度对色素合成的重要性[21]。舒华等通过降低光照强度，使茶树新梢叶绿素含量显著增加；同时叶绿素生物合成的前体ALA、PBG、Urogen Ⅲ等含量降低，而Proto Ⅸ、Mg-ProtoⅨ、Pchlide 含量升高，说明光照也是影响叶绿素及其前体物质积累的重要因子之一[19]。董立花在宽叶吊兰中发现，叶绿素生物合成受昼夜节律的调控[16]，推测可能是由于昼夜光照和温度的差异导致；本研究的结果也表明光和温度对叶绿素合成影响很大，且低温显著抑制叶绿素生物合成（图3）。

初始前体物质ALA 的合成和镁离子的插入步骤是植物叶绿素合成两个关键调控点[22]，但是不同的环境因素对叶绿素合成途径的影响是具有差异的。近几年来，不少学者对不同现象进行分析，探讨是叶绿素合成途径中哪一具体步骤起作用，对叶绿素合成方面的研究进行补充。董立花发现在金心吊兰的金心部分，叶绿素代谢途径中存在3 个受阻位点：ALA、Proto Ⅸ和Pchlide 的合成，由于金心吊兰金心部分在合成开始时ALA 已受到抑制，推测ALA 合成受阻可能是其形成黄色叶条纹的主要原因[23]；杨清等通过叶面喷施胺鲜脂（DA-6）提高ALA向PBG 转化的效率，从而使叶绿素积累量增加[24]；S.Cenkci 等发现铅导致萝卜（Brassica rapa L.）幼苗叶片ALA 积累，ALA 脱水酶活性降低，光合色素含量下降，且变化程度呈剂量依赖关系[25]；本研究也发现在玉米转绿过程中，低温也会抑制ALA 向PBG 转化（图1），说明ALA 向 PBG 的转化易受外界环境影响。Wu Y.等发现NaCl 胁迫下，黄瓜幼苗铁螯合酶（HEMH）基因表达下调，血红素积累降低[26]；本研究发现低温也会抑制玉米转绿过程中血红素的积累（图4），推测可能就是低温抑制铁螯合酶基因表达或者该酶活性导致的。喻敏等发现低温抑制冬小麦Chl a 向Chl b 的转化，导致叶绿素合成受阻[20]；本研究发现低温也抑制玉米转绿过程中Chl a 向Chl b 的转化（图3）。综上所述，不同的环境因子对植物叶绿素合成的调控位点可能不同。

低温胁迫是早春作物幼苗阶段经常面临的环境胁迫，常常导致作物减产，而植物的转绿过程对环境变化尤为敏感。通过对玉米转绿过程中叶绿素合成前体物质的分析，本研究发现低温通过影响ALA 向PBG 的转化和Mg-Proto Ⅸ向Mpe 的转化，降低 PBG、Urogen Ⅲ、Coprogen Ⅲ、Proto Ⅸ、Mpe、Pchlide、Childe 的积累量，进而降低Chl a 和Chl b产量；另外低温还会抑制Chl a 向Chl b 的转化，但更深入的调控机制还需进一步探究。