林燕青，谢安强，林 晗，洪 滔，陈 灿，吴承祯

（1.福建农林大学林学院，福州 350002；2.福建省高校森林生态系统过程与经营重点实验室，福州 350002；3.武夷学院生态与资源工程学院，福建 南平 354300）

木麻黄（Casuarina equisetifolia L.）为常绿乔木，原产于澳大利亚，广泛分布于热带和亚热带地区[1]，也是福建等地沿海海岸防护林主要树种。目前，木麻黄存在着林分二代更新困难、连栽导致生产力下降、防护功能减退的问题，这些问题都严重制约着木麻黄沿海防护林长期生产力的维护[2-4]。叶片是植物进行光合作用的重要器官，而叶绿素是植物光合色素中的重要色素分子，影响着植物对外界资源的利用及生物量的积累，是测定植物生长和营养状况的重要指标[5-8]。

对于植物叶绿素含量的测定方法中，传统浸取法步骤烦琐，耗时长，且叶绿素的损失较大，而SPAD-502 叶绿素相对含量测定法和叶绿素荧光分析技术是一种以光合作用为理论基础，利用植株体内叶绿素为天然探针，研究、探测植物光合生理状况及对外界因子的各种响应的新型植物活体测定和诊断技术，测定过程中均不会对叶片造成损伤，与其他苗木生理状况评价方法对比，具有对细胞无损伤、快速和灵敏等优点，是用于探测外界特殊环境条件下植物生理状况和光合作用能力的很好工具，且植株对特殊环境条件的适应程度与SPAD 值（即植物体内相对叶绿素含量）、Fv/Fm （即PS II 的最大或潜在的光化学效率，反映的是PS II 原初光能转化效率）、Yield（即PS II 实际光化学量子效率，反映了植物目前的实际光合效率）和qN（即非光化学淬灭系数）等参数有显著相关性，因此可作为观察接菌植物生长状况的指标[9-16]。植物内生真菌作为一种新型的天然活性物质资源宝库，近年来在促进植物生长、提高树木的抗逆能力和新陈代谢、促进植物天然物和代谢物分泌等方面均取得许多成果，关于利用叶绿素荧光分析技术评价植物外生菌根菌、AM（丛枝菌根Arbuscular mycorrhizae）真菌和根际促生细菌等对植物光合作用影响的报道已多见[17-24]，但将其应用于木麻黄内生真菌方面的研究尚未见报道[25-32]。为了探究木麻黄内生真菌是否对其生长过程中叶绿素相对含量以及荧光参数存在影响，不同的内生真菌是否存在差异，侵入方式之间对内生真菌影响效应，笔者进行较系统的研究，旨在科学回答内生真菌对木麻黄的叶绿素以及荧光参数存在影响的效应。

1 材料和方法

1.1 供试菌株及菌液的制备

28 株供试内生真菌包含青霉属（Penicillium spp.）、曲霉属（Aspergillus spp.）、叶点霉属（Phyllosticta spp.）、拟茎点霉属（Phomopsis spp.）和镰刀菌属（Fusarium spp.）5 种属别，其中青霉属菌株有2株，分别为菌株3 和菌株6；曲霉属菌株13 株，分别为菌株 5、7、13、14、17、20、23、25、30、37、53、57、63；叶点霉属菌株 7 株，分别为菌株 15、16、19、22、24、27、43；拟茎点霉属 1 株，为菌株 18；镰刀菌属 5 株，分别为菌株 45、46、50、52、54，均由本实验室采集于木麻黄植株全株[33]，目前部分菌种已保存于中国科学院微生物菌种保存中心，本研究中的部分菌株应用已获得国家发明专利（ZL201310068759.9、ZL201310068792.1、ZL201310068793.6）。

将纯化后的菌株用接种环挑取少量菌体（不含琼脂块），接入盛有60 mL 液体培养基 （含蛋白胨5.0 g，K2HPO41.0 g，酵母粉 2.0 g，MgSO40.5 g，葡萄糖 20.0 g；pH 6.8）的小锥形瓶中，然后将锥形瓶置于摇床内，于24 ℃转速120 r/min 下培养3 d 得到菌液[34]。将60 mL 菌液与90 mL 无菌水混合稀释，利用血球计数板检测稀释后菌液的浓度，浓度为8.75×105cfu/mL，接菌时配备 150 mL 该浓度的菌液，本试验所有接菌方式的菌液都采用这种浓度和剂量，以保证接菌时除了接菌方式不同，其他条件均一致。

1.2 无性系来源及处理

试验枝条采自多年生截杆母树上萌芽的小枝，共约3 400 余根，由福建省泉州市惠安县赤湖国有防护林场木麻黄惠安一号采穗圃提供。小枝长度约7～10 cm，用 60 mg/L （60×10-6）的萘乙酸浸泡至其基部2 cm 处，浸泡24 h 后立即用去离子水冲洗干净，放入灭菌后的小玻璃瓶中水培生根，去离子水没入小枝基部3 cm，白天力求阳光直射小枝，夜间移入室内保温，每天更换去离子水一次。木麻黄小枝水培22 d 后，得到选取出植物长度、分枝和根长基本一致的植株共2 584 株，其中留近半数的幼苗备用，其余幼苗移植盆栽中培养。

苗木移植与管理：用于移植的盆中各装有等量混合比例为3∶1 的黄心壤土和沙的混合土壤，并提前一天滴入10～15 滴/盆的甲醛（福尔马林）消毒液，并用塑料薄膜封盖盆口，消毒时间为24 h；苗木移植后在其生长的任何时期，均不施用任何肥料；盆栽苗均放置于试验地上由厚质透光塑料膜搭建的温室大棚里，除日常苗木管理以外，任其自由生长。

1.3 内生真菌的侵染

水培苗起苗时浸泡于菌液的方式简称S 方式（下同），先将水培获得的近半数幼苗用清水清洗干净，再用蒸馏水冲洗3 遍，接着将幼苗根系浸泡在贴了不同标签的菌液当中，每瓶菌液150 mL 平均浸泡15～20 株小苗，刚浸泡时，轻轻地摇动小苗，使其与菌液充分接触，随后室内放置10 h；浸泡完毕，用蒸馏水清洗3 次，最后将幼苗移植盆栽。

水培苗移植盆栽后浇灌菌液的方式简称P 方式（下同），将水培获得的近半数幼苗先移植盆栽，经过一周的恢复生长后再进行接种试验。接种方法为连续3 d 在木麻黄小苗根际周围均匀浇灌菌液150 mL，一个处理接菌苗木15～20 株。

本试验设对照苗木54 株，不接种任何菌株，其他处理相同，仅浇灌水溶液作为空白对照。本试验中的两种不同侵染方式同时进行，且内生真菌的定殖时间均为4 个月。

1.4 叶绿素相对含量测定

应用便携式叶绿素含量测定仪（SPAD-502，Minolta，Tokyo，Japan），测定叶中部的 SPAD 计数值代表叶绿素的相对含量。每个处理测定10 株，每株选取整个植株中间部位、同朝东南方向的枝条，采取5 根枝条并排压平的方式测量取平均值。

1.5 叶绿素荧光参数测定

应用 Photon Systems Instruments（PSI）公司生产的 Handy FluorCam 荧光成像仪在夜间19：00—22：00测定木麻黄苗木的叶绿素荧光参数，测定前先将苗木放入暗箱内，充分暗反应20 min，随后将苗木放于摄像头之下，调节焦距至能看清叶片图像为止。

测量的原始参数有：Fo（最小、基础或不变荧光强度等） 是光系统Ⅱ（PSⅡ）反应中心所有电子均处于完全开放时的荧光产量，它与叶片的叶绿素浓度有关；Fm（最大荧光） 是叶片经暗适应 20 min 后，光系统Ⅱ（PSⅡ）反应中心处于完全关闭时的荧光产量，可反映PSⅡ的电子传递情况；Fo'：（光下最小荧光）是光适应状态下全部PSⅡ中心都开放时的荧光强度；Fm'（光下最大荧光） 是光适应状态下全部PSⅡ中心都关闭时的荧光强度。

1.6 数据处理

所有数据处理以及图表制作均采用Excel 和SPSS 软件，用单因素方差分析和Duncan 多重比较法（P＜0.05）对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同接菌方式不同菌株处理对水培苗叶绿素相对含量的影响

在不同接种方式下，将28 株菌株分别接种后，分析不同接菌方式不同菌株处理后叶绿素相对含量，图1只列出不同接种方式表现好的前15 种菌株。由图1可以看出不同接菌方式不同菌株处理下，苗木叶绿素相对含量（SPAD 值）存在差异，不同直方图代表不同接菌方式下苗木叶绿素相对含量的变化，实验结果表明，S 接菌方式下苗木的叶绿素相对含量均大于P 接菌方式下苗木的叶绿素相对含量；而P 接菌方式下，接菌苗木的叶绿素相对含量均低于对照苗木的叶绿素相对含量，说明P 接菌方式下菌株对苗木的光合作用未起到促进作用。

对S（水培浸泡）接菌方式下叶绿素相对含量的方差分析表明，各菌株处理之间的苗木叶绿素相对含量存在显著差异，经过Duncan 多重比较分析，各处理的叶绿素相对含量较对照有显著提高，如表1所示。

与对照CK 木麻黄苗木相比，S 接菌方式下，叶点霉属的22 号和43 号菌株处理、镰刀菌属的46号菌株处理达到极显著差异水平，分别增加了27.5%、26.88%和 31.34%。另外，除了菌株 24 号、15号和14 号处理对木麻黄苗木叶绿素相对含量无提高以外，其他菌株处理对苗木叶绿素相对含量也有一定提高作用，并且镰刀菌属的46 号菌株处理对苗木叶绿素相对含量的提高作用与其他属种的菌株 37 号、23 号、18 号、16 号和 13 号相比，差异达到极显著。

2.2 不同接菌方式不同菌株处理对水培苗Fm、Fv和Fv/Fm的影响

荧光分析当中，Fm 和Fv 均反映着光系统Ⅱ的光化学活性。最大荧光（即Fm） 是光系统Ⅱ（即PSⅡ） 反应中心处于完全关闭状态下的荧光产量，它既可以反映光系统Ⅱ的电子传递情况，也能反映光是否受到抑制的情况（当Fm 降低时）；可变荧光（即Fv）为Fm 与Fo 之差，反映着光系统Ⅱ的电子受体——初级醌受体（即QA）的还原情况，研究发现，Fv 值的变化程度反映着植物对周围环境胁迫的忍耐能力[35]。

图1 不同接菌方式不同菌株处理下苗木叶绿素相对含量比较Figure 1 Comparison of the seedlings SPAD under different inoculated methods and treatments

表1 水培接菌方式不同菌株处理下叶绿素相对含量的多重比较分析Table 1 The multiple comparison analysis of SPAD among different inoculated treatments under the S method

在显著性水平为0.05 的前提下，单因素方差分析结果表明，S 接菌方式和P 接菌方式下，不同菌株接菌处理间的Fm、Fv 值差异显著情况如图2所示。

如图2所示，S 接菌方式下，除了菌株23 号以外，其他各菌株处理的Fm 值均较对照CK 有显著的提高，其中叶点霉属的菌株16 号与其他接菌菌株相比，差异达到显著水平，为对照苗木的2.13 倍；P 接菌方式下，除了菌株 5 号、24 号、27 号和 50 号以外，其他各接菌植株的Fm 值也均较对照CK 有显著的提高，但是增长幅度不如S 接菌方式，其中曲霉属的菌株7 号和25 号处理下的苗木，其Fm 值与其他接菌菌株相比，差异达到显著水平，分别较对照提高了39.57%和30.69%。

图2 不同接菌方式不同菌株处理下苗木Fm、Fv 的比较Figure 2 Comparison of the seedlings Fm and Fv under different inoculated methods and treatments

S 接菌方式下，除了菌株23 号以外，其余14 株接菌植株的Fv 均显著高于对照植株，其中叶点霉属的菌株16 号较其他接菌菌株的增幅最大，为对照苗木的2.21 倍；P 接菌方式下，接菌植株的Fv 值与对照CK 相比，有小幅度的增长，曲霉属的菌株7号和25 号作用下，苗木的Fv 值显著高于对照植株，分别提高了42.83%和34.81%。

荧光参数中，PSⅡ的实际光化学效率（即Fv/Fm）是研究植物光合生理状态的重要参数，反映着植物的潜在光合能力，同时也是研究植物胁迫的重要参数，在非胁迫的环境条件下，植物的物种与生长条件对其影响不大，该参数值保持在0.75 与0.85 之间，一旦受到外界胁迫作用，Fv/Fm 呈现明显的下降趋势，其值的减小意味着光系统Ⅱ反应中心的光化学损害与光能热耗散的增加[36-37]。对Fv/Fm 数据进行单因素方差分析，S 接菌方式和P 接菌方式下，不同菌株接菌处理间的Fv/Fm 值差异显著情况如图3所示。

图3 不同接菌方式不同菌株处理下苗木Fv/Fm 的比较Figure 3 Comparison of the seedlings Fv/Fm under different inoculated methods and treatments

如图3所示，S 接菌方式下，除了菌株17 号以外，其他14 株接菌植株的Fv/Fm 均高于对照CK，其中有9 株极显著高于对照植株，曲霉属的菌株13号处理下的苗木与对照CK 相比增幅最大，达到8.05%；P 接菌方式各菌株处理的苗木，其Fv/Fm 也较对照有一定的提高，但与对照之间差异不显著，Fv/Fm 值最大的为青霉属的菌株6 号处理，与对照苗木CK 相比，仅增加了4.10%；两种接菌方式中的共有曲霉属菌株23 号和叶点霉属菌株24 号，其Fv/Fm 的值，均为S 接菌方式大于P 接菌方式。结果说明了接菌处理有利于提高苗木的潜在光合能力，增强其对外界条件的适应能力，鉴于Fv/Fm 还是植物抗寒性的重要指标，且已在花旗松、茶树和甘蔗中得到应用[38-40]，因此，内生真菌的回接是否还能提高木麻黄水培苗木的耐寒性，还有待于进一步的试验研究。

2.3 不同接菌方式不同菌株处理对水培苗ΦPSII、Rfd和NPQ的影响

ΦPSII 能准确反映植物当前PSII 反应中心的实际光合效率状况，其值越大，光合结构电子传递能力越强，参与光化学反应的光能份额越大，越有利于提高植物的光合能力[41]，由表2和表3的参数特征值可以看出，S 接菌方式各接菌处理下，ΦPSII的值均大于对照CK，且在显著性水平为0.05 的前提下，曲霉属的菌株14 号、镰刀菌属的菌株45 号、叶点霉属的菌株43 号、镰刀菌属的菌株46 号、曲霉属的菌株17 号和13 号处理下苗木的ΦPSII 分别较对照显著增加了 61.09%、57.98%、53.31%、44.75%、40.08%和37.74%；P 接菌方式各接菌处理的ΦPSII 值也均高于对照CK，其中曲霉属的菌株25号处理和对照相比增幅最大，显著增加了55.25%。

表2 S 接菌方式不同菌株处理下木麻黄水培苗叶绿素荧光参数的特征值Table 2 Eigenvalues of chlorophyll fluorescence parameter of the water-cultured Casuarina seedling among different inoculated treatments under the S method

表3 P 接菌方式不同菌株处理下木麻黄水培苗叶绿素荧光参数的特征值Table 3 Eigenvalues of chlorophyll fluorescence parameter of the water-cultured Casuarina seedling among different inoculated treatments under the P method

Rfd 为叶片活力指标，反映叶片光合作用活力，即叶片潜在的光合作用量子转化效率，与植物光合作用呈线性关系，可直观反映植物的光合作用能力。S 接菌方式下，除了菌株 23 号、37 号、17 号和24 号处理以外，其他11 个菌株处理下苗木的Rfd值均高于对照苗木，且曲霉属的菌株20 号、拟茎点霉属的18 号和叶点霉属的19 号处理分别较对照CK 显著增加了 46.95%、40.85%和 19.92%；而 P 接菌方式下，各菌株处理下苗木的Rfd 值全部都小于对照苗木，其中的共有菌株24 号，无论S 还是P 接菌方式下，Rfd 值均为最小，说明该菌株的回接对木麻黄苗木的光合作用影响不大。

非光化学淬灭系数（NPQ）则为 PSⅡ天线色素吸收的光能以热的形式耗散掉的份额，其值越大，则表示植物用于热耗散的光能越多，植物光合作用的实际光能相应减少，从而降低植物的光合效率[42]，但是关于植物NPQ 值与光合作用的关系，目前有两种不同的观点：何炎红等[43-45]研究认为，NPQ 值的减小反映出苗木叶片的非化学能量耗散减少，这有利于促进同等外界条件下的苗木高效地利用所捕获的光能，以便更有效地利用于光合作用，因此，NPQ的值越小，苗木的光合性能越好；然而郑淑霞等[46]对阔叶树种叶绿素荧光特性的研究发现，植物NPQ 的值同qP 的值呈现极显著正相关，NPQ 的提高并未降低植株的光合效率。本试验结果显示，S 接菌方式下，接菌苗木的NPQ 值较对照相比有上升的趋势也有下降的趋势，其中Rfd 值表现好的拟茎点霉属菌株18 号、叶点霉属菌株19 号和曲霉属菌株20 号处理在NPQ 值的测定当中也均显著大于对照苗木，分别增加了337.94%、137.06%和234.71%，因此本研究同郑淑霞等人的研究结果相似，认为不能一概判定NPQ 的值越大光合效率越低，同时王丽敏[47]对杉木叶绿素荧光参数的研究中也得到这一结论；P 接菌方式下，仅镰刀菌属菌株54 号的NPQ 值大于对照苗木，较对照增加了17.65%，不如S 接菌方式下菌株18 号的增加量，P 方式其他14 个菌株均小于对照苗木的NPQ 值。

3 讨论与结论

光能被植物光合色素吸收后的去向有3 种：参与光化学反应；以热散失形式消失；荧光形式消耗。近年来叶绿素计SPAD-502 在农作物和林业技术上的应用逐渐广泛，其较传统分光光度计测定叶绿素的绝对含量来得方便快捷，易于携带特别适合林业研究的野外调查，能够快速、无损地测定活体叶片的叶绿素相对含量[48-51]，前人研究表明SPAD 值与叶绿素含量具有显著的相关性，结果差异不大，在一定条件下具有较强的一致性[52-55]；而叶绿素荧光分析技术也已被广泛应用于植物光合性能预测、植物抗逆生理以及农作物增产潜力测试等方面，大量的研究报道表明植物体内发出的叶绿素荧光不仅仅是一种现象，更包含了丰富的光合作用讯息，可被定量分析和评价其光合机构的功能及外界胁迫对其的影响[18，36，56-59]，因此植物叶绿素的相对含量和叶绿素荧光参数均能反应植物光合产物积累的情况，也同植物的光合作用能力有很大联系，其中，Fv/Fm这一叶绿素荧光参数比值，是目前被广泛用于衡量植物叶片光合性能的重要指标[22，48]。

试验结果表明，接种内生真菌对木麻黄水培幼苗的光合作用有显著的促进作用，且随着接菌方式及菌株处理的不同而异，试验中不同接菌方式不同菌株处理下的Fv/Fm 值均在0.8～0.9 之间。国外学者[60-61]研究表明，受胁迫叶片的该值一般在0.3～0.7之间，而在非胁迫条件下，健康叶片则在0.8～0.9 之间，这说明了本试验中的苗木在接菌后生长良好，且S 接菌方式下的菌株处理，对苗木的Fv/Fm 值有显著促进作用；S 和P 接菌方式中，共有的菌株为曲霉属的23 号和叶点霉属的24 号，从叶点霉属24号处理苗木的Fm、Fv 值来看，水培接菌方式效果较盆栽接菌方式的好，但从曲霉属23 号处理苗木的Fm、Fv 值来看，盆栽接菌方式效果较水培接菌方式的好，说明内生真菌对苗木光合生长的促进作用，会随着其对苗木的侵染定殖时间增长，而表现出更加明显的互利共生的效果，但P 接菌方式下的苗木仍然有待于进一步观察和研究。

叶片光合作用活力的测定中，S 接菌方式下苗木的Rfd 值显著高于对照苗木，而P 接菌方式下苗木的Rfd 值均小于对照苗木，与叶绿素相对含量的测定结果呈现了相似的规律，也同前期对该处理下新梢生长量的测定结果有一定的关联；大多数研究认为促生细菌对植物的光合作用影响是一种间接影响，即通过改善土壤性质，提高植物根系对水分、矿质营养等物质的吸收能力，从而最终提高植物的光合性能。本研究表明接种内生真菌有利于提高木麻黄苗木光系统Ⅱ的实际电子传递量子效率，增大用于光化学份额的光能，即加快苗木的实际光合效率进程，同时还能提高木麻黄苗木叶片光合作用活力，加速叶片潜在光合作用量子的转化，是否与接菌菌株能够改善土壤性质或促进木麻黄幼苗根系生长有关尚不明确，不同接菌方式和不同菌株处理的结果有一定差异，并且最佳接菌方式和功能菌株尚未确定，有待于对幼苗进行继续培养及测定研究。