李 媛，张晓洁，马 良，郭 婷，余 永，戴宏杰，周鸿媛，张宇昊,2,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.西南大学生物学研究中心，重庆 400715）

冷鲜肉是严格按照兽医检疫制度执行，对屠宰后的畜胴体进行冷却处理，使其温度（以后腿肉中心点为测量点）在24 h之内降至0～4 ℃，并一直保持在该温度范围内进行后续加工、运输及销售的生鲜肉[1]。国内冷鲜肉从生产商经冷链运输至代理商、零售商进行销售，销售地点主要为超市和农贸市场等。冷鲜肉的包装方式主要为真空包装和气调包装两种[2]，但目前市场上大多只是简单的塑料薄膜包裹后或直接没有任何包装便置于低温冷藏柜，导致冷鲜肉腐败加速，货架期缩短，无法充分满足日常的销售和食用。

塑料制品聚乙烯（polyethylene，PE）、聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）等是冷鲜肉包装的常用材料，具有阻气性良好、成本低等优点，但由于氧气的隔绝，肉色并非鲜红色，大大降低了消费者的接受度。近年来，活性包装因其可以保持冷鲜肉贮藏过程中的品质、延长货架期而成为研究热点[3]。明胶可以直接作为涂膜剂或制成膜材料用在食品表面以防止腐败变质，延长货架期[4]。由明胶制成的膜具有良好的热封性和较高的阻气、阻油性，物化性质易于调节，可作为活性包装膜广泛应用于食品包装[5]。然而，目前单一明胶膜还存在如质脆、力学性能差、易溶于水等显著缺点[6]，无法很好地满足实际应用的要求；因此，大量实验研究将明胶与其他物质复合后制成复合明胶膜，极大地增强了膜性能并扩展了明胶的应用范围[7]。Kaewprachu等[8]用含有儿茶素-溶菌酶的明胶膜和PVC分别对猪肉进行4 ℃冷藏保鲜，结果发现，含有儿茶素-溶菌酶的明胶膜包裹的猪肉具有更低的菌落总数和硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值，并且质量损失较少。Nowzari等[9]研究了明胶/壳聚糖复合膜对冷藏虹鳟鱼品质的影响，结果表明，贮藏至16 d时，对照组（未进行任何处理）的挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量已接近临界值25 mg/100 g，而明胶/壳聚糖复合膜处理组的TVB-N含量在20 mg/100 g左右，说明明胶/壳聚糖膜的应用可以延长虹鳟鱼的货架期。兔皮明胶作为哺乳动物源明胶，其凝胶特性要优于水产明胶，是较好的明胶来源；目前对于兔皮明胶的研究主要集中在其提取、性质测定以及明胶膜的制备。于玮等[10]用稀盐酸短时处理提取兔皮明胶，发现兔皮明胶具有良好的凝胶特性和较高的亚氨基酸含量，相对水产明胶而言是替代哺乳动物较好的明胶来源。杨晖[11]以兔皮明胶为原料，通过分析明胶添加量和甘油浓度对明胶膜结构和性能的影响，制备兔皮明胶膜，并与猪皮明胶膜作对比，发现兔皮明胶可以代替传统哺乳动物明胶用于生物降解膜的制备。但是，对兔皮明胶的应用研究还不够广泛，尤其是活性明胶膜领域的研究鲜有报道，有待进一步研究。

迷迭香酸（rosmarinic acid，RosA）是一种天然的水溶性酚类物质，具有很多生物活性，如抗氧化[12]、抑菌[13]、抗炎[14]、抗过敏[15]等，目前，RosA在食品上的应用研究主要集中于将其直接加入肉类制品和油脂中以延缓脂肪氧化和酸败。高辉等[16]将RosA加入火腿肠中，常温下测定过氧化值（peroxide value，POV）和TBARS值，结果发现，含有RosA的处理组与对照组（未进行任何处理）相比具有更低的POV和TBARS值，这说明RosA可以较好地延缓火腿肠的脂质过氧化。谢芳芳[17]将不同质量浓度的RosA与合成抗氧化剂二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）加入菜籽油中作对比，结果发现，0.4 g/L的RosA比0.2 g/L BHT具有更好的抗氧化效果。此外，也有实验将迷迭香提取物加入金枪鱼皮明胶中制备活性明胶膜，发现迷迭香提取物可以提高明胶膜的水阻隔性和抗氧化活性[18-19]。但是对于添加RosA的明胶膜在肉类保鲜中的应用鲜见报道。

本实验采用不同质量浓度（0、0.3、0.5、0.8 g/L）RosA制备兔皮明胶/RosA复合膜，通过测定pH值、菌落总数、TVB-N含量、TBARS值、硬度和色差等指标，探究兔皮明胶/RosA复合膜、PE/兔皮明胶/RosA复合包装膜对新鲜猪肉冷藏保鲜效果的影响，以期为后续明胶/RosA复合膜在冷鲜肉贮藏中的应用提供理论依据，并为制备一种天然抗氧化的活性包装材料提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

兔皮购于重庆阿兴记食品有限公司，原料获取后洗净冻藏于-20 ℃冰箱中备用；猪前腿肉购于重庆市北碚区永辉超市。

二甲基硅油、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、硅藻土、可溶性淀粉 成都市科龙化工试剂厂；甘油（纯度＞99%）、酚酞 生工生物工程（上海）有限公司；RosA（纯度97%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA） 杭州微生物试剂有限公司；2-硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA） 上海科丰实业有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JA3003B型电子天平 上海精天电子仪器有限公司；CJ-78-1型磁力搅拌器 上海将任实验设备有限公司；PE20型实验室pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；HH-4J型磁力搅拌恒温水浴 江苏金坛白塔新宝仪器厂；TA.XT2i物性测定仪 英国Stable Micro Systems公司；Ultra Scan PRO色差仪 美国Hunter Lab公司；SW-OJ-IFD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；Heraeus Multifuge X3R型离心机 美国赛默飞世尔科技公司；UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；YLD-2000型恒温培养箱 上海亚泰仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 兔皮明胶的制备

兔皮明胶的提取主要参照杨晖等[20]的方法，工艺如下：新鲜兔皮→除去皮下脂肪→脱毛→清洗、剪切→除杂蛋白→清洗→稀酸（质量分数1%盐酸）处理→提胶→过滤（用1.6 μm孔径的滤膜真空过滤）→热风干燥→成品明胶。

1.3.2 兔皮明胶/RosA复合膜的制备

称取4 g明胶溶于蒸馏水，以明胶的质量加入25%的甘油（增塑剂），室温下溶胀2 h。然后60 ℃水浴加热，将RosA溶于蒸馏水并加入到明胶溶液中，使明胶最终质量浓度为0.4 g/L，RosA最终质量浓度依次为0、0.3、0.5、0.8 g/L，搅拌使明胶与RosA形成均匀的液体。40 kHz、40 W超声处理10 min制得成膜液，取30 mL均匀地铺在130 mm×130 mm的塑料培养皿中，并在（45±1）℃的烘箱中干燥24 h，后将膜揭下并置于含有变色硅胶的干燥盘中干燥48 h，待测。

1.3.3 猪肉样品的制备

将超市购买的新鲜猪前腿肉分割成50 g左右的肉块，分别用兔皮明胶膜、兔皮明胶/RosA复合膜、PE包装袋、PE/兔皮明胶/RosA复合膜（明胶/RosA复合膜作为内膜包裹在猪肉表面，外层再用PE包装袋真空塑封）包装，未进行任何包装的样品作为对照组。样品在4 ℃冰箱中冷藏12 d，每隔2 d抽取样品并进行指标测定。

1.3.4 pH值的测定

参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》中肉及肉制品pH值的测定方法。取10 g猪肉样品，加入100 mL 0.1 mol/L氯化钾溶液，均质后测其pH值。

1.3.5 菌落总数的测定

菌落总数根据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定》进行测定。取5 g猪肉样品，切碎（工具消毒），加入45 mL灭菌生理盐水均质2 min，然后10 倍递增进行梯度（10-1～10-6）稀释，选择适宜浓度的稀释液注入PCA平板，于（36±1）℃下培养（48±2）h，每个稀释度做3 个平行。

1.3.6 TVB-N含量的测定

TVB-N含量的测定采用GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法。

1.3.7 TBARS值的测定

TBARS值的测定参照王超[21]的方法，取5 g猪肉样品，加入25 mL、体积分数20%的三氯乙酸溶液，再加入20 mL蒸馏水均质1 min，静置1 h后3 000×g离心10 min，过滤并用蒸馏水定容至50 mL。取2 mL滤液加入2 mL 0.02 mol/L TBA溶液在沸水浴反应20 min后用流动水冷却5 min，于532 nm波长处测定吸光度。1 mL体积分数20%三氯乙酸溶液、1 mL蒸馏水、2 mL 0.02 mol/L TBA溶液混合作为空白组。

1.3.8 质构分析

采用质构剖面（texture profile analysis，TPA）法进行质构分析，参数设置：探头型号TA5，测试前速率2 mm/s，测试速率1 mm/s，返回速率1 mm/s，测试距离4 mm，触发力5 g，间隔时间5 s。室温测量，主要分析硬度的变化。

1.3.9 色差的测定

使用Ultra Scan PRO色差仪对新鲜猪肉的L*（亮度）和a*（红绿）值进行测定，以白板作为色差测定的参比。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 17.0软件进行数据处理，数据以平均值±标准差表示，采用方差分析法进行显著性分析，利用Origin 8.6软件作图，每次实验设置3 个平行。

2 结果与分析

2.1 不同膜处理对猪肉冷藏过程中pH值的影响

图1 猪肉在冷藏过程中pH值的变化Fig. 1 Changes in pH of pork during refrigerated storage

图1 为不同包装方式下猪肉冷藏过程中pH值的变化，所有处理组的pH值均先下降后上升。贮藏的前2 d，pH值降低，这是新鲜猪肉在成熟过程中的糖酵解作用使得乳酸在肌肉中积累导致，此后，在内源蛋白酶和微生物作用下，蛋白质发生降解导致pH值逐渐上升[22]。与对照组、明胶膜和PE包装袋组相比，含有RosA复合膜包装的猪肉pH值上升速度都相对缓慢，且pH值随着RosA质量浓度的增加而降低，这可能是因为RosA具有抑菌作用，可以延缓微生物的生长，进而抑制了样品pH值的升高，质量浓度越高，抑菌效果越强。李荣贵等[23]研究发现，RosA对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等都具有明显的抑菌效果。Lara等[24]研究表明，含有RosA的柠檬香蜂草提取物可以降低猪肉饼的pH值，这可能是因为RosA是一种含多酚羟基的酸，其pH值为4.25±0.02。此外，与PE包装袋相比，PE/明胶膜包裹的猪肉pH值上升速率也较缓慢，这可能是因为明胶膜具有吸水性，作为内膜可以吸收并锁住猪肉内部渗出的水分，减少因汁液溢出而导致的微生物生长加速。

2.2 不同膜处理对猪肉冷藏过程中菌落总数的影响

在鲜肉冷藏过程中，腐败微生物的生长会影响肉制品的品质，缩短其货架期，GB/T 9959.2—2008《分割鲜、冻猪瘦肉》中规定，菌落总数限量应不超过6（lg（CFU/g））。图2为菌落总数在猪肉冷藏过程中的变化情况，初始菌落总数为4.78（lg（CFU/g）），对照组在第6天时菌落总数为6.21（lg（CFU/g）），超过了GB/T 9959.2—2008的限量标准，为腐败肉；0.3 g/L RosA明胶膜包裹的猪肉在第6天时为5.84（lg（CFU/g）），0.8 g/L RosA明胶膜在第8 天时为5.93（lg（CFU/g）），与对照组相比，货架期分别延长了约1、2 d，这表明随着RosA质量浓度的增加，复合膜的抑菌效应也逐渐增强，与pH值变化分析一致。孙峋等[25]研究表明，RosA可以较好地抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等常见食品污染菌的生长。单纯PE包装膜包裹和PE/0.8 g/L RosA明胶膜包裹的猪肉分别在第8、10天时菌落总数超过6（lg（CFU/g）），与对照组相比，货架期分别延长了2、4 d。总地来说，PE/RosA明胶膜的组合包装方式对于延缓猪肉腐败有明显效果。一方面，PE包装袋作为外层包装，可以较好地隔绝内部明胶膜与外界水分、CO2和微生物等的接触；另一方面，含有RosA的明胶膜可以吸收猪肉浸出的汁液，并在猪肉表面缓慢释放RosA，RosA具有一定的抑菌作用，可以降低由微生物引起的蛋白质分解速率，使猪肉保持良好品质。

图2 猪肉在冷藏过程中菌落总数的变化Fig. 2 Changes in total bacterial count in pork during refrigerated storage

2.3 不同膜处理对猪肉冷藏过程中TVB-N含量的影响

根据GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜（冻）畜、禽产品》规定，鲜畜、禽产品的TVB-N含量不超过15 mg/100 g。图3为不同包装方式下猪肉在冷藏过程中TVB-N含量的变化情况，随着冷藏时间的延长，所有处理组的TVB-N含量均呈上升趋势。第4天时，对照组和单纯明胶膜组的TVB-N含量分别为15.62、15.04 mg/100 g，超过标准；PE包装袋包裹猪肉在第6天时的TVB-N含量为15.21 mg/100 g，超过标准，这一结果表明，PE包装袋具有比单纯明胶膜更好的效果，这是由于明胶膜的阻隔性能略低于PE包装袋；第8天时，0.8 g/L RosA明胶膜组的TVB-N含量为16.54 mg/100 g，超过标准，与单纯明胶膜组相比，RosA的加入可以有效延缓猪肉TVB-N含量的上升，延长猪肉的贮藏期；此外，与0.8 g/L RosA明胶膜相比，PE/0.8 g/L RosA明胶膜包裹的猪肉在第10天时TVB-N含量为15.47 mg/100 g，具有更好的贮藏效果。

综合猪肉冷藏过程中菌落总数和TVB-N含量的变化，得到各处理组的货架期分别为：对照组4 d，单纯明胶膜组4 d，0.3 g/L RosA明胶膜组7 d，0.8 g/L RosA明胶膜组8 d，单纯PE包装膜组6 d，PE/明胶膜组7 d，PE/0.3 g/L RosA明胶膜组8 d，PE/0.8 g/L RosA明胶膜组10 d。

图3 猪肉在冷藏过程中TVB-N含量的变化Fig. 3 Changes in TVB-N content of pork during refrigerated storage

2.4 不同膜处理对猪肉冷藏过程中TBARS值的影响

不同包装方式下TBARS值在猪肉冷藏期间的变化如图4所示，随着冷藏时间的延长，所有处理组的TBARS值均呈上升趋势，与对照组相比，其他处理组的TBARS值都相对较低。冷藏初期猪肉的TBARS值为0.20 mg/kg，冷藏至12 d时，对照组、单纯明胶组、单纯PE包装组的TBARS值分别上升至1.70、0.97、0.68 mg/kg，与明胶膜相比，PE具有更好的贮藏效果，这是因为PE包装袋具有比明胶膜更好的阻隔氧气的作用；同时，0.8 g/L RosA明胶膜、PE/0.8 g/L RosA明胶膜组的TBARS值分别为0.46、0.33 mg/kg，含有RosA的包装膜包裹的猪肉TBARS值增长幅度普遍较小，这是因为RosA可以通过捕获过氧自由基来抑制过氧化链式反应的进行，阻断自由基链的传递和增长，从而延缓了脂肪氧化进程。与该研究结果相类似，Kaewprachu等[8]将含有儿茶素-溶菌酶的明胶膜（catechin-lysozyme incorporated gelatin film，CLGF）与PVC分别覆盖在盛有猪肉的托盘上，于4 ℃贮藏7 d，结果发现，CLGF覆盖的猪肉的TBARS值显著小于PVC组，这是因为儿茶素是一种有效的金属螯合剂和自由基清除剂，具有很强的抗氧化性，可以抑制脂肪氧化。

图4 猪肉在冷藏过程中TBARS值的变化Fig. 4 Changes in thiobarbituric acid reactive substances value of pork during refrigerated storage

2.5 不同膜处理对猪肉冷藏过程中硬度的影响

表1 猪肉在冷藏过程中硬度的变化Table 1 Changes in hardness of pork during refrigerated storage

猪肉在冷藏过程中硬度的变化如表1所示，在0～2 d内，所有处理组的猪肉硬度呈上升趋势，这是因为猪被宰杀后，猪胴体进入尸僵状态，肌肉收缩变硬而失去弹性，所以硬度升高。在2～4 d内，各处理组的硬度逐渐下降，这是因为在肌肉组织中酶及微生物的作用下，骨架蛋白以及肌原蛋白被分解，使得肌原纤维断裂，包围在肌原纤维周围的网络结构变得疏松，从而导致肌肉质地软化，硬度下降。4 d之后，所有含PE膜的处理组硬度持续下降，而对照组、明胶膜、0.3 g/L和0.8 g/L RosA明胶膜实验组上升，这是因为PE膜具有良好的密封性，可以防止猪肉失水，而明胶膜具有一定的水蒸气透过率，可与外界形成相对流通的环境，导致猪肉失水，使得硬度升高。当冷藏至第10天时，由于不含PE膜的猪肉水分损失严重，测得的硬度不再具有实际参考价值。贮藏至后期时，与单纯PE膜处理组相比，PE/RosA处理组随着RosA质量浓度的增加，硬度下降速率愈加缓慢，这可能是因为复合膜在水分子的作用下逐渐溶胀，膜中RosA缓慢迁移释放，因RosA具有一定的抗氧化和抗菌作用，从而有效延缓了猪肉硬度的下降。

2.6 不同膜处理对猪肉冷藏过程中色差的影响

猪肉在冷藏过程中L*值的变化如表2所示。L*值越大，亮度越大。随着冷藏时间的延长，所有处理组的L*值都有所下降，但是含有PE包装组的L*值整体高于对照组和对应的明胶膜处理组，这可能是由于冷藏过程中猪肉内部水分渗出，而明胶膜具有一定的水蒸气透过率，水分渗出后逐渐散发，相反，PE包装袋具有很好的密封性，渗出的水分会积于肉的表面，增强对光的反射能力，故表现为较高的L*值。

表2 猪肉在冷藏过程中色差L*值的变化Table 2 Changes in CIE L* value of pork during refrigerated storage

表3列出了猪肉在冷藏过程中a*值的变化。肌红蛋白的含量是影响猪肉肉色的主要因素，也直接影响着消费者的可接受度[26]。随着冷藏时间的延长，肌红蛋白与氧气的结合程度以及还原型、氧合型和高铁型肌红蛋白之间的构成比例对猪肉的色泽有重要影响。在冷藏过程中，所有处理组的a*值均先上升后下降，这与肌红蛋白受氧气氧化作用而生成氧合肌红蛋白，然后进一步氧化成为高铁肌红蛋白，肉色由红色变为鲜红色然后再转变为暗褐色有关。4 d后a*值逐渐降低，其中对照组下降速率最快，由10.34±0.75降低为2.84±1.12，与明胶膜、RosA明胶膜处理组相比，相应PE/明胶膜、PE/RosA明胶膜组的a*值虽然也逐渐下降，但是都保持有较高的a*值，这是因为外层用PE真空包装时，隔绝了大部分氧气；且与单独明胶膜组相比，含RosA的明胶膜组具有更高的a*值，是因为RosA在猪肉表面缓慢渗透释放，延缓了猪肉氧化，对猪肉色泽具有很好的保护作用。Kroll等[27]研究发现，酚类物质可以与肌红蛋白直接反应，延缓肌红蛋白的氧化和变色。阳晖[28]将仙草胶加入明胶中制得仙草胶/明胶膜，包裹在猪肉表面，于4 ℃下贮藏12 d，结果发现含有仙草胶的处理组具有更高的a*值，这是因为仙草胶具有抗氧化和抑菌作用，可以延缓氧化，延长肉色保持时间。

表3 猪肉在冷藏过程中色差a*值的变化Table 3 Changes in CIE a* value of pork during refrigerated storage

图5为不同包装方式包装的新鲜猪肉在贮藏期间的外观色泽变化，观察发现，对照组及单独明胶膜包装的猪肉颜色从开始的鲜红色逐渐转变为暗褐色。单独PE膜包装的猪肉初始为鲜红色，随着贮藏时间的延长，猪肉表面泛白，肉色不新鲜。以含RosA的明胶膜为内包、PE为外包的复合膜包装的猪肉在整个贮藏期间都保持着较好的色泽，这是因为内层为含有RosA的明胶膜时，一方面明胶膜中含有部分氧气，可使肌红蛋白氧化为氧合肌红蛋白而呈现鲜红色；另一方面，明胶膜可以锁住猪肉渗出的汁液，同时RosA在猪肉表面缓慢渗透释放，延缓猪肉进一步氧化，对猪肉色泽具有很好的保护作用。而外层用PE真空包装时，隔绝了大部分氧气，减少了因氧合肌红蛋白受氧气氧化作用生成高铁肌红蛋白而导致的肉色由鲜红色转变为暗褐色。由此说明PE/RosA明胶膜可以作为一种有效的活性包装材料用于冷鲜肉的贮藏保鲜。

图5 猪肉冷藏期间的色泽Fig. 5 Visual observation of color changes in pork during refrigerated storage

3 结 论

由于RosA具有抗菌和抗氧化作用，可通过向猪肉中渗透活性成分从而有效延缓微生物的生长和pH值的上升，并一定程度地抑制脂肪氧化；与对照组相比，0.8 g/L RosA明胶膜和PE/0.8 g/L RosA明胶膜处理均有效抑制了菌落总数和TVB-N含量的增加，货架期分别延长4 d和6 d左右；贮藏至末期时，PE/RosA明胶膜处理组包装的猪肉有较高的硬度、L*值和a*值，具有相对较好的品质，即当外层用PE包装袋密封时，冷藏效果更佳。因此，RosA的加入可以延缓猪肉腐败变质，从而延长货架期，同时PE/RosA明胶膜可以作为一种有效的活性包装材料，用于冷鲜肉的贮藏保鲜。