王祖文，杨忠敏，杨 敏，黄先智，丁晓雯,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，食品科学与工程国家级实验教学示范中心，重庆 400716；2.西南大学科技处，重庆 400716）

肝损伤可由药物副作用、过量饮酒、摄入环境中的某些有毒物质、长期高脂饮食等因素引起[1]，是危害人类身体健康最常见的疾病之一。随着人们生活水平的提高，高脂食物在日常饮食中占比越来越高。研究表明，高脂饮食会导致非酒精性脂肪肝，造成由单纯性脂肪肝转变为非酒精性脂肪肝炎，进一步演变成肝硬化甚至是肝癌[2]。高脂饮食造成的肝损伤具体表现在机体内脏脂肪堆积、糖脂代谢异常、胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性、肝细胞膜受损、出现炎症和氧化应激、细胞凋亡等方面[3]。

近年来大量研究证明中药有治疗肝损伤的作用，如葛根、苦参、柴胡等[4]，它们含有多糖、黄酮、生物碱等多种功能成分，具有维护实验动物肝脏细胞膜完整，抑制血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平升高，清除机体自由基、增加抗氧化能力，降低肝损伤动物体内肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β的水平、减少炎症反应，减缓肝细胞凋亡等作用[5]。桑叶为药食同源，生物碱是桑叶的主要活性成分之一。研究表明，桑叶生物碱具有降糖[6]、降脂[7]、抑制病毒活性[8]、抗肿瘤细胞生长[9]、减轻肾损伤[10]等作用，但目前关于桑叶生物碱对肝损伤的保护作用鲜有报道。因此，本研究采用高脂饮食建立小鼠肝损伤模型，以桑叶生物碱为研究对象，初步探讨桑叶生物碱改善高脂饮食小鼠肝损伤的作用与机理，为桑叶保护肝脏相关保健食品的开发提供理论依据，为桑叶产业发展提供新思路，为高脂饮食导致肝损伤的预防和治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

桑叶（品种为‘胜利大叶’）粉末由重庆畜牧科学院蚕研所提供。

清洁级雄性昆明小鼠200 只（4 周龄），体质量（20±2）g，由重庆中药研究院提供，生产许可证号：SCXK（渝）2012-0006。

基础饲料 重庆滕鑫比尔实验动物有限公司；高脂饲料为实验室自制，配方参照文献[11]进行适当修改：基础饲料78.9%（质量分数，下同）、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇1%、胆酸钠0.1%。

AST、ALT测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；苏木精染液、伊红染液 南昌雨露实验器材有限公司；动物组织RNA提取试剂盒、cDNA第一链反转录试剂盒 北京天根生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

EG1105H型石蜡切片机 德国Leica公司；包埋盒江苏世泰实验器材有限公司；DHP-9082型恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；生物显微镜日本OLYMPUS株式会社；ALPAAI-4LSC型高速离心机德国Christ公司；DW-HL438型超低温冰箱 合肥美菱股份有限公司；XW-80A型微型漩涡混合仪 上海精科实业有限公司；Synergy H1型酶标仪 美国基因有限公司；5880型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；NanoDrop ND-2000C型微量紫外分光光度计、CFX96型实时定量反转录聚合酶链式反应（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪、T100型PCR仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 桑叶生物碱制备

按料液比1∶30（m/V）称取桑叶粉，60 ℃、600 W超声处理60 min，重复提取2 次，合并滤液，减压浓缩；将浓缩液以2.1 BV/h流速过D101大孔树脂得到纯化液；再将纯化液以2.5 BV/h流速过732型阳离子树脂吸附，先用蒸馏水洗至中性，再用2 BV 0.5 mol/L氨水洗脱得到氨水洗脱液；将氨水洗脱液以2.1 BV/h流速过AB-8大孔树脂，洗脱液冷冻干燥得样品[12-13]。采用硅钨酸沉淀法[14]测得样品中总生物碱质量分数为85.57%。

1.3.2 动物分组及饲养

本研究获得西南大学实验动物保护协会许可，小鼠按照西南大学实验动物保护和使用规则饲养，室温22～25 ℃，相对湿度40%～60%，12 h明暗交替（9∶00～21∶00），自由进食、饮水。200 只昆明小鼠适应性喂养7 d后，随机分为正常对照组、高脂对照组和低、中、高剂量组（桑叶生物碱剂量分别为50、100、200 mg/kg）5 组，每组40 只。除正常对照组给予基础饲料外，其余组均给予高脂饲料喂养。桑叶生物碱各剂量组灌胃0.1 mL/10 g不同剂量桑叶生物碱，正常对照组和高脂对照组给予等量生理盐水，每日1 次，连续灌胃16 周。每次灌胃前称体质量以调整给药体积。

1.3.3 肝脏系数的测定及肝组织病理学观察

分别于灌胃的第4、8、12、16周末处死各组小鼠各10 只。小鼠禁食不禁水16 h，眼球取血于含有肝素钠的真空采血管中，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，收集上清液，于-80 ℃保存备用。采血完毕后，颈椎脱臼处死小鼠，快速取出肝脏，用冷生理盐水漂洗除去表面血液，滤纸拭干，称质量，按下式计算肝脏系数[11]。在肝脏同一位置切取小块肝组织，用质量分数10%福尔马林溶液固定48 h，石蜡包埋，切片（5 μm），苏木精-伊红染色，在显微镜下进行肝组织病理学观察。

1.3.4 血浆AST、ALT活力测定

血浆AST、ALT活力的测定按照相应试剂盒说明书步骤进行。

1.3.5 肝组织TNF-α、IL-10、Bax、Bcl-2 mRNA表达的测定

按照动物组织RNA提取试剂盒说明书提取纯化操作方法提取肝脏组织总RNA，对RNA进行纯度测定。按反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA第一链，再进行PCR扩增。取上述反转录产物1 μL作为反应模板，反应体系10 μL。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，如表1所示。qRT-PCR条件：95 ℃、4 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 个循环。以β-actin作内参基因，分别测定肝组织TNF-α、IL-10、Bax、Bcl-2 mRNA的相对表达量，结果以2-ΔΔCt法计算。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 数据统计与分析

实验结果均以平均值±标准差表示，采用SPSS 20.0软件对结果进行单因素方差分析，P＜0.05为差异显著。采用Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 桑叶生物碱对肝脏系数的影响

在动物实验中，脏器质量和脏器系数是药物慢性实验指定检测项目，通过实验动物的脏器质量、脏器系数可大体确定脏器损伤或病变的程度[15]。本研究测定了桑叶生物碱对高脂饮食小鼠肝脏系数的影响，结果如表2所示。

表2 桑叶生物碱对小鼠肝脏系数的影响Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on liver index in mice

由表2可知，与正常对照组相比，喂饲4、8、12、16 周后，高脂对照组小鼠肝脏系数分别显著增加了10.67%、11.24 %、12.38%、7.58%（P＜0.05），提示高脂饮食可能会导致小鼠的肝脏损伤。与高脂对照组相比，除低剂量组在灌胃4 周时肝脏系数未下降外，其余时间各剂量组小鼠的肝脏系数均显著下降（P＜0.05），并于8 周末恢复到正常水平，与正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。

2.2 桑叶生物碱对高脂饮食小鼠ALT、AST活力的影响

ALT、AST主要分布于肝细胞内，当肝细胞出现损伤或坏死时，肝细胞膜通透性增加，ALT、AST被释放入血，引起血液中含量上升，因此血液中ALT、AST活力的升高反映了肝脏损伤程度[16-17]。本研究测定了各组小鼠血浆AST、ALT活力，以考察桑叶生物碱对高脂饮食小鼠肝损伤的影响。

2.2.1 桑叶生物碱对高脂饮食小鼠血浆AST活力的影响

表3 桑叶生物碱对小鼠血浆AST活力的影响Table 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma AST activity in mice

由表3可知，实验期间正常对照组小鼠血浆AST活力基本保持稳定。与正常对照组比，高脂对照组小鼠血浆AST活力显著升高（P＜0.05），且随着喂饲高脂饲料时间的延长，AST活力呈现递增趋势，在第4、8、12、16周，小鼠血浆AST活力分别增加了48.02%、53.44%、71.16%、82.06%，说明持续摄入高脂饮食会不断加重肝细胞损伤，破坏细胞膜，释放出大量AST。与高脂对照组比，随着桑叶生物碱灌胃剂量增加和灌胃时间延长，各剂量组的小鼠血浆AST活力均有所下降。灌胃至16 周末，低、中、高剂量组小鼠血浆AST活力分别下降了29.84%、42.02%、46.44%，中、高剂量组小鼠的AST活力恢复到正常水平，与正常对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

2.2.2 桑叶生物碱对高脂饮食小鼠血浆ALT活力的影响

表4 桑叶生物碱对小鼠血浆ALT活力的影响Table 4 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma ALT activity in mice

由表4可知，实验期间正常对照组小鼠血浆ALT活力基本保持稳定。与同时期的正常对照组比，第4、8、12、16周末，高脂对照组小鼠血浆ALT活力分别增长了83.33%、57.12%、62.85%、70.41%（P＜0.05）。与高脂对照组比，随着桑叶生物碱灌胃剂量增加和时间延长，各剂量组小鼠血浆ALT活力均有所下降。从第12周末开始，中、高剂量桑叶生物碱灌胃的小鼠血浆ALT活力均恢复到正常水平，与正常对照组比差异不显著（P＞0.05）。

2.3 桑叶生物碱对高脂饮食小鼠肝组织病理学的影响

肝脏组织结构能够直观反映肝脏的损伤程度。为了研究桑叶生物碱对高脂饮食小鼠肝脏的影响，通过对各实验组小鼠肝脏染色、镜检，考察灌胃桑叶生物碱粗提取液4、8、12、16 周后对小鼠肝脏组织结构的影响，结果如图1所示。

图1 各组小鼠肝组织病理切片图（100×）Fig. 1 Histomorphological images of liver tissue in each group (100 ×)

由图1可知，实验期间正常对照组小鼠肝组织结构形态正常、质地均匀，肝细胞呈规则多边形，大小相似，胞质极丰富，细胞核清晰易见。随着高脂饲料喂饲时间的延长，高脂对照组小鼠肝组织胞浆内分布的脂滴逐渐增加，部分细胞核被脂滴挤压至胞浆边缘，周围可见弥漫性肝细胞脂肪变性，大量肝细胞明显肿胀。随着低、中剂量桑叶生物碱灌胃时间的延长，肝细胞的形态与排布逐渐趋于正常，肝组织胞浆内脂滴、肝细胞紊乱有所改善；而整个实验期间，当灌胃高剂量桑叶生物碱时，小鼠肝组织形态、大小基本恢复正常，脂肪的聚集现象不明显，细胞核的大小均较正常，肝细胞呈多边形，与正常对照组比无明显差异。

2.4 桑叶生物碱对肝脏炎症因子mRNA表达的影响

炎症反应与一些细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-10等密切相关。在肝脏损伤的过程中，炎症体被激活是一种常见的病理生理过程[18]。TNF-α是一种由单核细胞和巨噬细胞产生的单核因子，具有促炎作用[19]。肝脏中许多细胞都能分泌IL-10，其具有消除炎症的作用[20]。如果肝脏发生损伤，TNF-α mRNA表达量增加，而IL-10 mRNA表达量减少。因此，本研究着重考察肝脏组织中TNF-α、IL-10 mRNA表达情况，从而判断高脂饮食诱导肝脏损伤的炎症反应严重程度和桑叶生物碱是否具有抑制炎症的作用。

2.4.1 桑叶生物碱对肝组织TNF-α mRNA表达的影响

图2 桑叶生物碱对小鼠肝组织TNF-α mRNA表达的影响Fig. 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on the mRNA expression of TNF-α in liver tissue of mice

由图2可知，实验期间正常对照组小鼠肝脏TNF-α mRNA表达水平基本保持稳定。与正常对照组比，高脂对照组小鼠肝脏TNF-α mRNA表达水平显著上升（P＜0.05），在4、8、12、16 周末分别增加了233.33%、225.60%、222.03%、217.09%，说明高脂饮食引起炎症反应，小鼠肝细胞中TNF-α mRNA表达水平增加，但与喂饲时间无明显关系。与高脂对照组比，随着桑叶生物碱灌胃时间的延长，各剂量组小鼠肝脏TNF-α mRNA表达量均呈现降低趋势；在16 周末，灌胃低、中、高剂量桑叶生物碱小鼠肝脏TNF-α mRNA表达量分别下降了47.41%、48.90%、68.56%，高剂量组小鼠的TNF-α mRNA表达量恢复至正常水平，与正常对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

2.4.2 桑叶生物碱对肝组织IL-10 mRNA表达的影响

图3 桑叶生物碱对小鼠肝组织IL-10 mRNA表达的影响Fig. 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on the mRNA expression of IL-10 in liver tissue of mice

由图3可知，实验期间正常对照组小鼠肝脏IL-10 mRNA表达量基本保持稳定。与正常对照组比，高脂对照组小鼠IL-10 mRNA表达量显著降低（P＜0.05），随着喂饲时间的延长，表达量呈现下降趋势，4、8、12、16 周分别降低了26.49%、41.69%、42.34%、57.04%。与高脂对照组比，灌胃桑叶生物碱的各剂量组小鼠肝脏IL-10 mRNA表达量随着时间延长逐渐上升；在16 周末，低、中、高剂量组小鼠肝脏IL-10 mRNA表达量分别提高了70.64%、137.12%、155.30%；且中、高剂量组IL-10 mRNA表达量恢复至正常水平，与正常对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

2.5 桑叶生物碱对小鼠肝脏细胞凋亡因子表达的影响

肝损伤通常会引起肝细胞的凋亡，其中Bcl-2家族参与介导细胞的凋亡[21]，具有代表性的是促进细胞凋亡因子Bax和抑制细胞凋亡因子Bcl-2，其在细胞凋亡调控中起重要的作用。肝组织中Bcl-2水平升高和Bax水平降低表明细胞对凋亡的抵抗性增强，标志着药物对肝脏有保护作用[22-23]。因此，本研究考察桑叶生物碱对高脂饮食小鼠细胞凋亡因子Bax和Bcl-2 mRNA表达量的影响。

2.5.1 桑叶生物碱对肝组织Bax mRNA表达的影响

图4 桑叶生物碱对小鼠肝组织Bax mRNA表达的影响Fig. 4 Effect of mulberry leaf alkaloids on the mRNA expression of Bax in liver tissue of mice

由图4可知，实验期间正常对照组小鼠肝组织Bax mRNA表达量基本保持稳定。与正常对照组比，高脂对照组小鼠的肝组织Bax mRNA表达量显著升高（P＜0.05），于4、8、12、16 周分别升高了216.00%、250.00%、217.39%、213.04%。与高脂对照组比，灌胃桑叶生物碱的各剂量组小鼠Bax mRNA表达量显著下降（P＜0.05），且随着喂饲时间延长逐渐下降；在16 周末，桑叶生物碱低、中、高剂量组小鼠肝脏Bax mRNA表达量分别下降了43.06%、51.39%、68.06%，高剂量组小鼠该指标恢复至正常水平，与正常对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

2.5.2 桑叶生物碱对肝组织Bcl-2 mRNA表达的影响

图5 桑叶生物碱对小鼠肝组织Bcl-2 mRNA表达的影响Fig. 5 Effect of mulberry leaf alkaloids on the mRNA expression of Bcl-2 in liver tissue of mice

由图5可知，实验期间正常对照组小鼠肝组织Bcl-2 mRNA表达量基本保持稳定。与正常对照组比，高脂对照组Bcl-2 mRNA表达量显著下降（P＜0.05），于4、8、12、16 周分别下降了44.64%、44.44%、50.00%、38.46%。与高脂对照组比，灌胃桑叶生物碱中、高剂量组小鼠Bcl-2 mRNA表达量在4 周末显著升高（P＜0.05）；而低剂量组小鼠Bcl-2 mRNA表达量在8 周末显著升高（P＜0.05）；12 周末，灌胃桑叶生物碱的低、中、高剂量组小鼠肝脏Bcl-2 mRNA表达量分别上升了59.26%、77.78%、74.07%，均恢复至正常水平，与正常对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

3 讨 论

桑叶广泛分布于全国各地，其作为中药的历史悠久。2015版《中华人民共和国药典》中记载桑叶“甘、苦、寒，归肺、肝经，具有疏散风热、益肝通气、清肝明目等功效”[24]，桑叶营养丰富、无毒副作用，可作为药食两用。现已有不少研究证明，作为桑叶中主要活力成分的生物碱具有降糖、降脂等功能[19]，但其保肝作用鲜有报道，本实验以高脂饮食小鼠为考察对象，研究桑叶生物碱对高脂饮食引起肝功能异常的改善作用。当肝细胞受损时，ALT、AST释放入血，浓度升高。研究发现，喂饲高脂饲料的同时灌胃桑叶生物碱，随着灌胃剂量的增加和灌胃时间的延长，桑叶生物碱能有效降低小鼠脏器系数，降低血浆中ALT、AST活力，维持肝功能正常，与肝脏病理切片结果一致。

当长期处于高脂饮食状态下，机体内脂肪含量的增多和脂肪细胞的分化，会产生一系列的细胞因子[26]。TNF-α是一种强有力的炎症细胞因子，在许多炎性疾病和协调细胞因子级联反应中发挥关键作用，因此TNF-α对于维护慢性炎症至关重要[27-28]。而IL-10是由活化的免疫细胞产生的关键抗炎细胞因子，在控制和消除炎症中起重要作用。本研究发现桑叶生物碱能下调高脂饮食小鼠的促炎因子TNF-α mRNA表达，上调抗炎因子IL-10 mRNA表达，减少炎症反应。这可能与桑叶生物碱中的特征物质1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）有关。有研究表明DNJ可通过促进血脂血糖的转运代谢来改善小鼠肝损伤[29-30]。此外，DNJ还能显著降低ALT、AST水平，减轻肝组织大泡性脂肪变性，降低促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6水平[31]。

细胞因子和炎症介质还可能引起肝细胞凋亡，进一步增加肝组织损伤[32-33]。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡、自吞噬等生命过程的重要调控因子，抗凋亡蛋白成员和促凋亡蛋白成员之间的协同作用共同决定细胞是否进入凋亡程序[34-35]，其中Bcl-2抗细胞凋亡的机制之一是拮抗促凋亡基因Bax。本研究发现灌胃桑叶生物碱可抑制高脂饮食小鼠肝细胞中促凋亡因子Bax mRNA表达，促进Bcl-2 mRNA表达，减少细胞非正常凋亡。

综上认为，桑叶生物碱可改善高脂饮食诱导的小鼠肝损伤，其机制可能与降低炎症反应和抗肝细胞凋亡有关。该研究结果有助于高脂饮食诱导肝损伤的预防和治疗。