王 莹 ，杨海朝 ，刘凤霞 ， 薛 刚 ，黄亚平

（1.南阳理工学院，河南南阳 473004；2.河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南南阳 473004；3.河南顺天生物科技有限公司，河南南阳 473300）

烟碱是生产绿色食品理想的高效杀虫剂和生物性农药[1-2]，用途十分广泛。在卷烟工业中用天然烟碱配制的香精具有显著增加香气和劲头的作用，在叶组配方中减少了对上等烟叶的用量，降低了卷烟成本[3]。随着烟草工业、精细化工、制药、有机合成、国防、农药等的迅速发展，市场对烟碱的需求与日俱增。烟碱的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法、离子交换树脂法、超临界流体萃取法、液膜分离法等[4-7]。水蒸气蒸馏法是提取天然烟碱较为原始的工艺，利用烟碱在碱性条件下能与水蒸气共同挥发而不分解的特性[5]进行提取，该方法流程简单、操作方便，但是会耗费大量的能源、效率低。国内外也有报道用超临界二氧化碳萃取技术从烟草中提取烟碱，该方法虽然提取率较高，但设备投资和维修费用大、设计和制造技术要求高、生产能力低。溶剂萃取法是将烟叶浸泡后用石灰乳处理净化，用Na2CO3去除残存的Ca2+离子，澄清液用氯代烯烃、乙醚、氯仿、溶剂油等有机溶剂萃取，萃取液用硫酸洗脱，烟碱从有机相转移到水相成硫酸烟碱，萃取液用硫酸洗脱，烟碱从有机相转移到水相成硫酸烟碱，多次富集得硫酸烟碱产品。但该方法操作步骤复杂、萃取时间较长，而且会产生大量废水，为废水处理带来困难。

对于生产烟碱粗品来说，最简单的就是酸性水提法，但传统浸提法存在提取时间长的缺点，如果加以微波和超声波辅助，可大大缩短提取时间。谢长芹和陈丽金等人[6-7]以废次烟叶为原料研究了微波法提取烟叶和烟末中烟碱的技术，周民杰和朱松等人[8-9]利用超声波提取低次烟叶中烟碱。试验同时研究优化微波和超声波辅助提取烟废弃烟叶及烟杆中烟碱的工艺，为企业萃取烟碱提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

材料：河南省种植的废弃烟叶和烟杆，河南顺天生物科技有限公司提供。

试剂：氢氧化钠、氯化钠、硅钨酸 盐酸、98%浓硫酸等，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

仪器：BILON-2008型低温超声波萃取仪，上海比朗仪器有限公司产品；XH-MC-1型微波辅助反应仪，北京祥鹄科技发展有限公司产品；752N型紫外可见分光光度计，上海精科实业有限公司产品；TGL-16C型高速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；BSA224S-CW型电子天平，Sartorius中国有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 废弃烟叶及烟杆中烟碱含量及提取率的测定

（1）原料中烟碱含量测定。蒸馏时称取1 g粉碎后的烟叶或烟杆于500 mL蒸馏瓶中，加入20 g NaCl和2 g NaOH，用30 mL水将烟杆冲下，立即将蒸馏瓶连接于水蒸气蒸馏装置进行蒸馏。用内含10 mL 1 mol/L H2SO4溶液的250 mL三角瓶作为接收器，冷凝管末端应浸入H2SO4溶液中。蒸馏过程中蒸馏瓶内的液体体积应保持恒定，必要时可适当加热。收集220～230 mL馏出液，用小试管取馏出液1 mL，加1滴浓度为2.4 mol/L的HCl溶液和1滴浓度为0.036 mol/L硅钨酸溶液，不显浑浊时可停止蒸馏。取下容量瓶，同时用水冲洗冷凝管末端，确认容量瓶处于室温。用水定容至刻度，摇匀。若馏出液不澄清，则将其过滤。

紫外分光光度法馏出液中总植物碱的含量：用移液管吸取10 mL的馏出液于50 mL容量瓶中，用浓度为0.025 mol/L的H2SO4溶液定容至刻度，以浓度为0.025 mol/L的H2SO4溶液作参比，用紫外分光光度计测定溶液在波长236，259，282 nm处的吸光度。若259 nm处的吸光度超过0.7，应取较小体积的馏出液重新稀释测定。

烟碱含量的结果计算如下：

式中：F——稀释倍数；

m——试样质量，g；

N——总质量百分含量，%；

W——试样的水分含量，%。

2次平行测定精确至0.01%，测定结果之差不大于0.05%。

（2）烟碱提取率计算。干废弃烟叶或烟杆经晒干、粉碎后，水浴浸提、过滤得滤液，滤液经浓缩即得烟碱粗品，称量，浓缩物再经浓度为1 mol/L的硫酸溶液吸收后，取出10 mL浓缩液用浓度为0.025 mol/L的硫酸定容至50 mL，紫外分光光度计测定其纯度。计算公式如下：

式中：M——浸提液中浓缩物质量，g；

X——浓缩物中烟碱含量，g；

M0——原料质量，g；

X0——原料中烟碱含量，g。

1.2.2 烟碱提取的单因素试验设计

（1）pH值对烟碱提取率的影响。称取5份5.0 g粉碎的废弃烟叶或烟杆，分别置于5个250 mL的锥形瓶中，在料液比1∶15，浸提温度70℃，浸提时间2 h，浸提次数1次的条件下，向5个锥形瓶中各加入75 mL pH值分别为2，3，4，5，6的水溶液，在水浴振荡摇床上振荡萃取，得到的萃取液经浓缩稀释后，采用紫外分光光度法测定烟碱的吸光度，并利用公式（2）得出烟碱的提取率。

（2） 萃取时间对烟碱提取率的影响。称取5份5.0 g粉碎的废弃烟叶或烟杆，分别置于5个250 mL的锥形瓶中，再加入75 mL pH值为2的水溶液，在浸提温度70℃，浸提次数1次的条件下，设定水浴萃取时间分别为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h，在水浴振荡摇床上振荡萃取，得到的萃取液经浓缩稀释后，采用紫外分光光度法测定烟碱的吸光度，并利用公式（2） 得出烟碱的提取率。

（3） 萃取次数对烟碱提取率的影响。称取4份3.0 g粉碎的废弃烟叶或烟杆，分别置于4个250 mL的锥形瓶中，每次加入45 mL pH值为2的水溶液，70℃下在水浴振荡摇床上振荡萃取2 h，分别萃取1，2，3，4次，将每次萃取得到的萃取液合并经浓缩稀释后，采用紫外分光光度法测定烟碱的吸光度，并利用公式（2）得出烟碱的提取率。

（4） 料液比对烟碱提取率的影响。称取5份3.0 g粉碎的废弃烟叶或烟杆于5个250 mL的锥形瓶中，分别按 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30的料液比加入pH值为2的水进行浸提，浸提温度70℃，浸提时间2 h，浸提次数1次，得到的萃取液经浓缩稀释后，采用紫外分光光度法测定烟碱的吸光度，并利用公式（2）得出烟碱的提取率。

1.2.3 微波和超声波辅助萃取烟碱的正交试验设计

在单因素试验的基础上，利用微波或超声波辅助萃取做三因素三水平的优化试验，从单因素试验中选出适当反应条件，对其进行优化试验，选取pH值、反应时间、料液比3个因素，采用L9（34）正交表进行优化试验。其中，选定微波辅助功率400 W，辐射温度65℃。

2 结果与分析

2.1 废弃烟叶和烟杆中烟碱含量的测定

根据水蒸气蒸馏法测定干烟叶中烟碱的含量，用紫外分光光度计测定馏出液中烟碱含量。

单因素试验结果见表1，单因素试验的方差分析见表2。

结果表明，河南豫烟的废弃烟叶和烟杆中烟碱含量的平均值分别为1.583%和0.387%。

2.2 pH值对烟碱提取率的影响

表1 单因素试验结果

表2 单因素试验的方差分析

分别选取不同pH值条件下的水溶液对废弃烟叶和烟杆进行浸提，置于70℃的水浴摇床上，浸提2 h后抽滤，滤液浓缩，测浓缩物的质量及其烟碱含量，利用公式（2） 计算烟碱的提取率，结果见表1。以提取率为指标进行单因素方差分析，结果见表2。经方差分析可知，不同pH值之间差异达到显著或极显著水平（废弃烟叶F=10.696**，烟杆F=4.8*）。pH值5和pH值4条件下废弃烟叶及烟杆的提取率较高，它们之间差异不显著（显著性检验略）。

2.3 萃取时间对烟碱提取率的影响

用pH值4的水溶液对废弃烟叶和烟杆进行浸提，分别选取不同的萃取时间，置于70℃的水浴摇床上，浸提后抽滤，滤液浓缩，测浓缩物的质量及其烟碱含量，利用公式（2）计算烟碱的提取率（表1），当萃取时间为1 h和2 h时提取率较高。以提取率为指标进行单因素方差分析（见表2）。由表2可知，不同提取时间下对废弃烟叶烟碱提取率达到极显著水平（F=13.465**），对烟杆烟碱提取率不显著。

2.4 萃取次数对烟碱提取率的影响

用pH值4的水溶液对废弃烟叶和烟杆进行浸提，分别选取不同的萃取次数，每次萃取1 h，置于70℃的水浴摇床上，浸提后抽滤，滤液浓缩，测浓缩物的质量及其烟碱含量，利用公式（2）计算烟碱的提取率（见表1）。以提取率为指标进行单因素方差分析（见表2）。

结果说明，萃取次数2～3次提取率高；方差分析结果显示，萃取次数差异达到极显著水平（废弃烟叶F=36.684**，烟杆F=13.222**），最好次数为2～3次。

2.5 料液比对烟碱提取率的影响

用pH值4的水溶液对废弃烟叶和烟杆进行浸提，分别选取不同的料液比，萃取1次，萃取时间为1 h，置于70℃的水浴摇床上，浸提后抽滤，滤液浓缩，测浓缩物的质量及其烟碱含量，利用公式（2） 计算烟碱的提取率（见表1）。以提取率为指标做单因素方差分析（见表2）。

由表1可知，料液比1∶25时提取率高。方差分析说明料液比差异达到极显著水平（废弃烟叶F=136.079**，烟杆F=46.114**），最佳料液比1∶25。

2.6 正交试验

选取pH值、料液比、微波时间或超声波时间3个因素设计正交试验，利用微波或超声波辅助萃取烟碱。

正交试验因素与水平设计见表3。采用公式（2）测定各组试验所得烟碱提取率。超声波和微波辅助萃取烟碱的正交试验结果见表4。

超声波和微波辅助萃取的正交试验结果（见表4）说明，从表观上看微波辅助萃取提取率高于超声波辅助萃取。极差分析结果是超声波辅助萃取废弃烟叶的最优组合为A1B3C3，即pH值4，超声时间180 s，料液比1∶25；超声波辅助萃取烟杆的最优组合为A2B3C3，即pH值5，超声时间180 s，料液比1∶25；微波辅助萃取废弃烟叶的最优组合为A2B2C3，即pH值5，微波时间20 s，料液比1∶25；微波辅助萃取烟杆的最优组合为A2B3C3，即pH值5，微波时间30 s，料液比1∶25。从最优顺序看均为B＞A＞C，说明超声波和微波辅助效果最好。

表3 正交试验因素与水平设计

表4 超声波和微波辅助萃取烟碱的正交试验结果

续表4

表5 正交试验的方差分析

正交试验的方差分析见表5。

由表5可知，超声波和微波辅助萃取的B因素达到显著水平，因此B因素应该控制在最优B3水平。尽管A因素不显著，结合极差分析说明，A因素应为A2水平。C因素可以在选任何一个水平，为节省浓缩时间和浓缩能耗C因素应在C1水平。最后确定最佳组合为A2B3C1，即pH值5，料液比1∶15，超声时间180 s或微波时间20～30 s。

3 结论

（1）单因素试验表明，河南豫烟废弃烟叶和烟杆中烟碱含量的平均值分别为1.583%和0.387%，低于云南和贵州。如要变废为宝，应综合考虑烟油、烟浸膏等的提取。研究确定pH值5和pH值4条件下废弃烟叶及烟杆的提取率较高。试验没有设定碱性条件是因为在碱性条件下，烟碱为游离烟碱。当萃取时间为1 h和2 h时提取率较高，萃取次数2～3次提取率高，最佳料液比1∶25。

（2） 超声波和微波辅助萃取的正交试验结果表明，超声波和微波辅助萃取的效果达显著，通过极差分析和方差分析确定最佳组合均为A2B3C1，即pH值5，料液比1∶15，超声时间180 s或微波时间20～30 s。