王昭懿，张 鲲，周丽媛，程 娇，温 凯，于 梅

（山东农业工程学院食品科学与工程学院，山东济南 250100）

枯草芽孢杆菌是一种典型的革兰氏阳性好氧菌，具有很强的酶活性，并且对人畜安全，是一种环境友好型菌种且能形成芽孢[1]。芽孢作为一种休眠体，能经受高温、干燥、紫外线、多种化学物质及电离辐射等逆境[2]，自由存在的芽孢作为一种隐藏的生命，一旦环境条件合适，芽孢便可以萌发成营养细胞。研究表明，枯草芽孢杆菌的芽孢进入动物肠道中，便能迅速萌发成具有新陈代谢作用的营养型细胞，这种营养型细胞能在动物体内分泌多种消化酶、维生素及氨基酸等物质，进而调节肠道菌群平衡，改善动物的健康水平和生产性能[3-6]。因此，添加枯草芽孢杆菌制成益生菌制剂，被广泛应用于畜禽饲料工业。而饲用益生菌制剂是以有效的活菌数作为重要指标，产品中必须含有相当数量的活菌才能发挥作用。但是，随着保存时间的延长，活菌数量不断减少，其有效活菌数降低，影响其使用效果[7]。但枯草芽孢杆菌所特有的芽孢拥有非常惊人的休眠能力，普通条件下可保存几年至几十年的活性，可有效延长贮存期。

然而枯草芽孢杆菌饲用益生菌制剂芽孢产率低的问题依旧存在。并且国内枯草芽孢杆菌多采用固体发酵方式[8-10]进行生产，原料成本高、灵活性差，不便于机械化生产，而且菌体存活率和芽孢产率相对较低[11]。相较而言，液体发酵技术所采用的培养基原料来源广泛、价格低廉，生产效率高，更有利于大规模生产，开发潜力大[12-13]。

通过优化枯草芽孢杆菌液体培养基成分及培养条件，以期获得较高芽孢产率保证菌体活性，为饲用益生菌制剂生产企业提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和培养基

菌种：枯草芽孢杆菌，青岛农业大学中韩食品研究中心提供。

菌种活化培养基：营养琼脂（NA） 3.3 g，无水氯化钙0.005 g，七水硫酸镁0.01 g，四水氯化锰0.01 g，蒸馏水100 mL。

液体种子培养基：营养肉汤（NB） 1.8 g， 无水氯化钙0.007 5 g，七水硫酸镁0.01 g，四水氯化锰0.02 g，蒸馏水100 mL。

1.1.2 仪器和试剂

YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器、HPX-9272MBE型电热恒温培养箱、JHT系列净化工作台、B203LED型生物显微镜、SHA-C型水浴恒温振荡器。试验所用试剂均为国产分析纯，所用水均为二次蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

将放置在4℃冰箱内保藏的枯草芽孢杆菌转接至固体基础培养基中，在45℃恒温下培养24 h。

1.2.2 液体培养

冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体培养基种子培养基中，按照液体基础培养条件进行培养。

液体基础培养条件：转速100 r/min，温度45℃，初始pH值7，接种量2%，装液量100 mL/250 mL，培养时间3 d。

1.2.3 镜检

固体培养：利用五点取样法从固体平板中取菌至无菌离心管内，制成菌悬液摇匀待用。

液体培养：吸取200μL菌体至无菌离心管内，制成菌悬液摇匀待用。

蘸取菌悬液至载玻片上，火焰固定，滴适量孔雀石绿，染色5 min，冲洗，待干后滴入适量番红染液染色5 min，冲洗晾干待用。

在100倍油镜下记录细菌数与芽孢数，计算芽孢产率。

芽孢产率计算方法见公式（1）。

式中：A——芽孢产率，%；

a——芽孢个数，106CFU/mL；

b——菌体个数，106CFU/mL。

1.3 设计

1.3.1 培养基配方优化单因素试验

（1） 不同MnCl2·4H2O用量对芽孢产率的影响。选取 5个 MnCl2·4H2O 用量 0.30，0.35，0.40，0.45，0.50 g，置于100 mL培养基，按照基础培养方法进行培养，染色镜检，记录芽孢数和菌体数，计算芽孢产率。

（2） 不同MgSO4·7H2O用量对芽孢产率的影响。选取 5 个 MgSO4·7H2O用量 0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 g，置于100 mL培养基，按照基础培养方法进行培养，染色镜检，记录芽孢数和菌体数，计算芽孢产率。

（3） 不同CaCl2用量对芽孢产率的影响。选取6个不同 CaCl2用量 0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 g置于100 mL培养基，按照基础培养方法进行培养，染色镜检，记录芽孢数和菌体数，计算芽孢产率。

（4） 不同K2HPO4·3H2O用量对芽孢产率的影响。选取 6 个 K2HPO4·3H2O 用量 0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 g，置于100 mL培养基，按照基础培养方法进行培养，染色镜检，记录芽孢数和菌体数，计算芽孢产率。

1.3.2 培养基配方优化的正交试验

根据单因素试验结果以芽孢产率为指标，设计四因素三水平L9（34）正交试验，确定最适培养基配方。

1.3.3 培养条件优化单因素试验

（1） 不同初始pH值对芽孢产率的影响。选取4，5，6，7，8，9为初始pH值。使用1.3.2所得最佳培养基配方，按照基础培养方法进行培养，染色镜检，记录芽孢数和菌体数，计算芽孢产率。

（2）不同装液量对芽孢产率的影响。选取50，75，100，125，150，250 mL 6种装液量。使用1.3.2所得最佳培养基配方，按照液体培养方法进行培养，染色镜检，记录芽孢数和菌体数，计算芽孢产率。

（3）不同培养时间对芽孢产率的影响。选取1，2，3，4，5 d 5种培养时间。使用1.3.2所得最佳培养基配方，按照液体培养方法进行培养，染色镜检，记录芽孢数和菌体数，计算芽孢产率。

（4） 不同接种量对芽孢产率的影响。选取1%，2%，4%，6%，8%，10%6种接种量。使用1.3.2所得最佳培养基配方，按照液体培养方法进行培养，染色镜检，记录芽孢数和菌体数，计算芽孢产率。

1.3.4 培养条件优化正交试验

根据单因素试验结果以芽孢产率为指标，设计四因素三水平L9（34）正交试验，确定最适液体培养条件。

2 结果与分析

2.1 培养基配方优化单因素试验结果

2.1.1 不同MnCl2·4H2O用量对芽孢产率的影响

锰离子是细胞中许多酶的激活剂，有利于枯草芽孢杆菌芽孢的生成[13]。

不同MnCl2·4H2O用量对芽孢产率的影响见图1。

由图1可知，随着MnCl2·4H2O用量的增加，枯草芽孢杆菌芽孢产率呈现先升高后降低的趋势。MnCl2·4H2O用量达到0.45 g时，芽孢产率达到48.1%，对枯草芽孢杆菌芽孢的生长显现促进作用。因此，选取MnCl2·4H2O最佳用量为0.45 g。

图1 不同MnCl2·4H2O用量对芽孢产率的影响

2.1.2 不同MgSO4·7H2O用量对芽孢产率的影响

镁离子和硫离子，作为细胞中重要的酶激活剂，随着添加量的变化会对菌体及芽孢的生长会产生不同的影响，根据结果分析枯草芽孢杆菌产率变化。

不同MgSO4·7H2O用量对芽孢产率的影响见图2。

图2 不同MgSO4·7H2O用量对芽孢产率的影响

由图2可知，当MgSO4·7H2O用量为0.5 g时，芽孢产率达到55.2%，使芽孢产率得到显著提升。但超过此用量，芽孢产率便开始降低，对芽孢生长产生不利影响。因此，选取MgSO4·7H2O最佳用量为0.5 g。

2.1.3 不同CaCl2用量对芽孢产率的影响

钙离子是某些胞外酶的稳定剂、蛋白酶等的辅因子，也是细菌形成芽孢和某些真菌形成孢子所需要的重要元素[14]，分析枯草芽孢产率的变化。

不同CaCl2用量对芽孢产率的影响见图3。

图3 不同CaCl2用量对芽孢产率的影响

由图3可知，在一定范围内，随着CaCl2用量升高，菌种产芽孢数量越多，芽孢产率也呈现上升趋势。用量升至0.15g时，芽孢产率高达57.7%，对芽孢生长具有明显促进作用；当继续增加用量，该无机盐对芽孢生长开始出现抑制作用，不利于芽孢产率的提升。因此，CaCl2最佳添加量为0.15 g。

2.1.4 不同K2HPO4·3H2O用量对芽孢产率的影响

不同K2HPO4·3H2O用量对芽孢产率的影响见图4。

图4 不同K2HPO4·3H2O用量对芽孢产率的影响

由图4可知，最适K2HPO4·3H2O用量为0.2 g，此时芽孢产率为59.3%，对芽孢生长起到显著促进作用，用量过高或过低都不利于芽孢的生长，所以选择K2HPO4·3H2O最佳用量为0.2 g。

2.2 最适生长培养基确定

根据以上单因素试验结果，以芽孢产率为指标考查锰离子、镁离子、钙离子、钾离子的不同用量对芽孢产率的影响，设计四因素三水平L9（34）正交试验，确定最适培养基条件。

L9（34）正交试验因素与水平设计见表1。

表1 L（934）正交试验因素与水平设计/g

L9（34）正交设计及结果见表2，SPSS方差分析结果见表3。

表2 L9（34）正交设计及结果

由表2可知，极差R值的大小为D＞B＞C＞A，即影响枯草芽孢杆菌芽孢产率的主次顺序为钾离子＞镁离子＞钙离子＞锰离子；正交试验方差分析结果（表3） 显示，各因素各水平差异极显著（p＜0.01），得出A1B1C2D3为最优水平。

表3 SPSS方差分析结果

对最优水平A1B1C2D3与试验结果最优A2B1C2D3进行验证对比试验，A1B1C2D3的芽孢产率为64.8%，A2B1C2D3的芽孢产率为64.59%，表明A1B1C2D3的液体培养基更佳，最佳培养基组合为每100 mL培养基中锰离子0.4 g，镁离子0.4 g，钙离子0.15 g，钾离子0.3 g。

2.3 培养条件优化单因素试验结果

2.3.1 不同初始pH值对芽孢产率的影响

不同初始pH值对芽孢产率的影响见图5。

图5 不同初始pH值对芽孢产率的影响

由图5可知，随着培养基初始pH值的增加，产孢率呈现先上升后下降的趋势，pH值为7时芽孢产率最大达64%，pH值过高或过低培养条件下芽孢产率均偏低，得出液体培养最优pH值为7。

2.3.2 不同装液量对芽孢产率的影响

不同装液量对芽孢产率的影响见图6。

图6 不同装液量对芽孢产率的影响

由图6可知，随着装液量的增加，产孢率呈现先上升后下降的趋势；最适液体培养枯草芽孢杆菌芽孢生长的装液量为100 mL/250 mL，此时枯草芽孢杆菌芽孢产率最大，为65%。

2.3.3 不同培养时间对芽孢产率的影响

不同培养时间对芽孢产率的影响见图7。

图7 不同培养时间对芽孢产率的影响

由图7可知，随着培养时间的增加，产孢率呈现先上升后下降的趋势，最适液体培养枯草芽孢杆菌芽孢生长的培养时间为3 d，此时枯草芽孢杆菌芽孢产率最大，为67.7%。

2.3.4 不同接种量对芽孢产率的影响

不同接种量对芽孢产率的影响见图8。

图8 不同接种量对芽孢产率的影响

由图8可知，随着接种量的增加，产孢产率出现2个峰值，即接种量为2%时芽孢产率为68.6%，接种量为8%时芽孢产率为66.7%，考虑节省成本，选取2%为最佳接种量。

2.4 最适培养条件确定

设计四因素三水平L9（34）正交试验，确定最适培养条件。

L9（34）正交试验因素与水平设计见表4。

表1 L9（34）正交试验因素与水平设计

L9（34）正交试验设计及结果见表5，SPSS方差分析结果见表6。

由表 5 可知，极差 R'值大小为 B'＞D'＞C'＞A'，即影响枯草芽孢杆菌芽孢产率的主次顺序为接种量＞培养时间＞初始pH值＞装液量；正交试验方差分析结果显示，除装液量外，各因素各水平差异极显著（p＜0.01），得出 A'3B'3C'2D'2为最优水平。

表5 L9（34）正交试验设计及结果

表6 SPSS方差分析结果

对最优水平A'3B'3C'2D'2与试验结果最优A'3B'3C'2D'1进行验证对比试验，A'3B'3C'2D'2的芽孢产率为72.10%，A'3B'3C'2D'1的芽孢产率为70.50%，表明A'3B'3C'2D'2的液体培养条件更佳，即最优培养条件组合为装液量125 mL/250 mL，接种量4%，初始pH值7，培养时间3 d。

3 结论

枯草芽孢杆菌芽孢生长的培养基配方为营养肉汤1.8 g，无水氯化钙0.15 g，七水硫酸镁0.40 g，四水氯化锰0.40 g，硫酸氢二钾0.30 g每100 mL培养基；最佳产孢培养条件为初始pH值7，装液量125 mL/250 mL，培养时间3 d，接种量4%，使液体培养枯草芽孢杆菌芽孢产率最终能达到72.1%。

结果表明，在培养基优化方面钾元素对芽孢产率影响最为显著，添加适当的K2HPO4·3H2O有助于维持和调节细胞渗透压的，对于芽孢的生长可能产生不同程度的促进作用，在培养条件方面接种量对芽孢产率影响最为显著，接种量会直接影响发酵情况，过大会引起溶氧不足，最佳接种量会有利促进芽孢产率的提升。

数据可作为工业生产的参考，部分培养基配方与培养条件还可进行进一步的探索研究，若应用于生产中，将会为饲料生产企业节约成本，增加收益。