孔宁宁，杨 勇，姜慧涛

（河北体育学院，河北 石家庄 050041）

益生菌是一种有益于人体健康的产品，具有免疫调节、促使肠道功能的改善、促进消化和预防腹泻等功能。目前，益生菌被广泛应用于人类生活的各方面，可作为辅助添加食品和膳食补充剂[1]。香菇（Lentinus edodes） 中提取出重要的生物活性物质香菇多糖，其具有增强人力免疫力、促进肠胃消化和恢复等功能。长期摄入含有香菇多糖成分的食物，可以稳定肠道消化功能，提高身体免疫能力，在药品和保健类食品中应用前景广阔[2]。运动员需要大量的日常训练，在日常运动中的高强度运动，对胃肠道产生强烈的应激刺激，使得肠胃正常生理功能运转受损，胃肠道中菌落的结构遭到破坏，最终会因为胃粘膜功能的损伤和调节失衡引发运动型肠胃综合症，使得肠胃功能紊乱。研究表明，保证运动员肠道菌群的多样性和丰度可有效改善其症状，成为防治运动性胃肠综合征的新方法[3]。咀嚼片是一种在口腔内嚼碎后咽下的片剂形式，根据需要可制成不同形状的异形片，目前市面上存在较多的保健品咀嚼片，保存及使用较为方便，是市场热销的产品，在医药与食品领域均得到广泛应用，并且益生菌咀嚼片的制备工艺较为成熟，片剂中的益生菌存活率较高[4]，本研究根据益生菌和香菇多糖对肠道微生态的改善作用，设计开发出一种香菇益生菌复合咀嚼片，选择体育系在校大学生作为研究对象，探究益生菌香菇复合咀嚼片对运动员的肠胃调节作用。采用超声波协同酶法提取香菇多糖工艺，具有条件温和，提取周期较短等优点[5]。

1 原材料与方法

1.1 原材料

干香菇，采购于本地蔬菜食品超市；菌株、无水酒精、葡萄糖、苯酚、DEAE-纤维素，采购于昊宏生物制剂销售中心；柠檬酸、甘露醇、可溶性淀粉、预胶化淀粉、可压蔗糖、喷雾干燥一水乳糖、硬脂酸镁、食用粉沫香精，采购于安泰食品添加剂有限公司。

1.2 主要仪器

超声波细胞粉碎机，南京以马内利仪器设备有限公司；紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；台式低速离心机，广州吉迪仪器有限公司；HH-M4数显恒温水浴加热锅，常州市金坛友联仪器研究所；WN-20万能粉碎机，南京科立华仪器仪表；FRE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DZF-6090真空干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；PHS-3C酸度计，上海悦丰仪器有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器、流式细胞仪、电热恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、可见光分光光度计、自动部分收集器、高速冷冻离心机、压片机等，上海一恒科技有限公司。

1.3 制作步骤

益生菌香菇咀嚼片的制作流程主要为：香菇多糖的提取、益生元活性的筛选和咀嚼片的压制成型。

1.3.1 香菇多糖的提取工艺

香菇多糖的提取按照以下步骤进行：香菇粉碎→超声波提取→pH调节→复合酶提取→灭酶→离心→浓缩沉淀→冷冻→干燥→香菇多糖纯化→多糖含量测定。

实验研究结果表明，超声波提取优化工序为：料液比为1∶15（g·mL-1），超声处理温度条件是70℃，超声处理时长为12 min，酶解时长为50 min，复合酶的添加量为3%（复合酶成份质量比为木瓜蛋白酶:纤维素酶:果胶酶为1∶1∶1），酶解的温度条件为60℃，酶解的pH为5.5，在此优化条件下香菇多糖提取率为12.46%[5]。最终香菇多糖纯度为88.15%。

1.3.2 益生元活性的筛选

制备香菇多糖培养基→菌株培育活化→菌株筛选→测定菌株生长曲线→测定香菇多糖对植物乳杆菌益生元的活性影响。

为了更多地发挥香菇多糖的优势，得到活性更高的益生元，实验最终决定采用多糖含量为88.15%的中性香菇多糖和有益菌植物乳杆菌C88结合使用的方法，生产制成益生菌咀嚼片。

1.3.3 咀嚼片的压制成型

选择预胶化淀粉、喷雾干后加乳糖、可压性蔗糖、甘露醇、硬脂酸镁、食用粉沫香精作为生产益生菌咀嚼片的辅料。按照比例辅料0.3 g，香菇多糖益生菌0.2 g进行混合，混合充分后。在压力设定为200 MPa的条件下，每一粒香菇多糖咀嚼片的质量设定为0.5 g，最后将原料和辅料混合搅拌均匀，在设定的压力下直接压制成圆形咀嚼片。

原辅料准备过目筛→原料与辅料预混过筛3次→压片→包装。

采用相同的方法制备不含香菇多糖和益生菌，剩余成分含量相同的咀嚼片，作为对照组咀嚼片进行实验[6]。

1.4 试验方法

1.4.1 试验分组

选择体育系在校大学生100名，保证所有选取的在校大学生都正常参加高强度课程训练，各个专业的均涉及且人数均等，男女比例均等，年龄分布在20岁～22岁，无任何家族遗传史。试验前经过医院体检，健康状况均为良好，对香菇多糖无过敏症状。按照性别和专业均衡，将100名体育系大学生分为2组，每组50人，分别为实验组和对照组。要求试验期间，试验组学生每天服用2次香菇多糖益生菌咀嚼片，每次服用6片，连续服用100 d。对照组服用不含香菇多糖和益生菌的咀嚼片，摄入量和服用时间与试验组保持一致。所有体育系大学生不服用任何其他药物，并且遵守专业饮食专家的指导建议，合理控制饮食，并保持每日饮食结构一致。

1.4.2 指标检测

试验期结束后5 d内，采集所有体育系大学生的静脉血和粪便3次。

体重指标：记录体育系大学生的初始体重和终末体重，计算体重减少量，分析体育系大学生体重的变化情况。血清指标：将采集到的血液样本凝固60 min，3 000 r·min-1离心分离 10 min，收集上层血清，平均分成2份，放入-80℃冰箱保存备用。其中一份按照ELISA试剂盒说明书测定人体胃泌素、胃动素、IgA和IL-2的含量，另一份用来检测巨噬细胞和树突细胞的含量。粪便pH测定：取新鲜粪便0.1 g，用1.0 mL蒸馏水溶解震荡使其混合均匀。离心分离30min，试样出现分层现象，取上层清液，用数显pH计测其pH。粪便水分含量测定：取少量粪便放置于鼓风干燥箱里烘干3 h，称量前后的质量，计算质量变化，得出粪便含水量。粪便氨含量测定：采用纳试剂分光光度法检测粪便氨含量，取新鲜粪便0.1 g，向其加入吸收液5 mL，搅拌混合均匀后，再向其加入Ⅰ级水，使总容积达到10 mL，用波长为425 nm的光照射该试样适当时间，然后用仪器测定该试样的吸光度，从而计算出试样中氨含量。短链脂肪酸含量测定：采用气相色谱法，取干燥的粪便0.1 g，加入10.0 mL蒸馏水溶解，充分震荡和搅拌，然后进行分离处理，转速12 000 r·min-1离心10 min，取适量（大于3 mL）试样的上层清液，然后通过0.45 μm的滤膜过滤所取试样，完成后，用取样器取滤液3 mL，加入0.2 mL的50%H2SO4和2.0 mL乙醚，充分震荡后，转速12 000 r·min-1离心10 min，最后取上层溶液进行气相色谱分析。粪便主要菌落种类数量变化测定：取粪便0.1 g，然后用灭菌生理盐水稀释到适宜浓度并震荡混合均匀，随后取 50 μL 涂布于 LBS、MRS+NNLP、VRBDA、BEA培养基上进行无菌培养，条件37℃培养 24 h～48 h。分别检测乳杆菌、肠杆菌、双歧杆菌和肠球菌，以显微镜镜检、革兰氏染色等方法鉴定菌种类别，并对菌落计数统计。

1.5 数据处理

所得的数据均使用SPSS软件进行分析，采用均数±标准差（x±s） 的形式表示。不同剂量的试验组间与对照组的试验数据对比，均采用方差分析的方法，按照统一的标准进行对比，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果分析

2.1 体重指标

试验组和对照组人员试验期间必须保证身体状况良好，饮食统一合理安排。对照组体育系大学生的体重变化为（-2.27±1.30） kg，试验组体育系大学生的体重无明显变化（P＞0.05）。试验组人员的主观调查结果显示，消化和排便感觉明显顺畅，表明香菇多糖和益生菌咀嚼片的使用，有效促进了体育系大学生的肠道蠕动，改善了消化功能，达到了轻微减重的效果。

2.2 血清指标

试验组和对照组的体育系大学生的血清中各指标检测数据结果见表1。

从表1中可以看出，与空白对照组相比，试验组人员胃泌素和胃动素表达水平显著较高，说明实验组人员的肠胃消化功能更好；实验组人员IgA和IL-2表达水平显著高于对照组，巨噬细胞高于对照组，由于香菇多糖是一种生物调节剂，可以进行人体的免疫调节，与益生菌联合使用，通过促进肠道蠕动，使得实验组人员肠道免疫功能更好，肠道功能更健康。

表1 体育系大学生血清指标检测结果

2.3 粪便指标

2.3.1 粪便pH、水分含量和氨含量的结果分析

试验组和对照组的体育系大学生的粪便中氨含量、水分含量和pH见表2。

表2 体育系大学生粪便理化指标检测结果

由表2可知，试验组体育系大学生粪便pH明显低于对照组，表明香菇多糖和益生菌结合使用时，能够有效地促进短链脂肪酸等酸性物质的产生，从而使碱性物质减少，所以能够使肠道的pH降低。由于肠道内的腐生菌生存环境pH较高，代谢旺盛，容易产生致癌物质，因此服用香菇多糖益生菌咀嚼片能有预防肠道疾病的产生[6]。

试验组体育系大学生连续服用100 d香菇多糖益生菌咀嚼片后，粪便中的水含量同样明显低于对照组，结合2组大学生粪便的实际情况，对照组大学生的粪便相对较稀，实验组大学生粪便成型度较好，表明香菇多糖益生菌咀嚼片具有促进粪便成型、促进排便的作用。

试验组体育系大学生连续服用100 d香菇多糖益生菌咀嚼片后，粪便中的氨含量明显低于对照组大学生，且P＜0.05，表明益生菌可以有效地抑制肠道里有害菌的繁殖和成长，增强肠道对蛋白质的吸收利用，从而降低粪便中的氨含量。

2.3.2 肠道微生物含量的比较

实验组和对照组体育系大学生的肠道微生物含量检测数据结果见表3。

表3 体育系大学生肠道微生物检测结果

从表3可以看出，试验组体育系大学生粪便中乳杆菌、双歧杆菌的数量比对照组显著升高，肠道内有害菌落肠杆菌和肠球菌数量减少，表明实验组大学生的肠道菌落更加健康。植物乳杆菌C88作为益生菌，可以非常快速地在肠道内定植，并且快速繁殖生长，从而使有益菌数量增加，导致有害菌数量减少；香菇多糖作为活性物质，能够有效提高人体免疫[7]，其调整肠道菌落的主要原因可能是通过增强机体部分免疫细胞的功能，创造了对双歧杆菌等有益菌有利的生长繁殖环境，使其能够快速繁殖成长。所以该益生菌咀嚼片对改善肠道菌落种类和数量具有非常显著性效果。

3 结论

香菇作为名贵的药食兼用菌，一直是食品科研的前沿热点。随着食品加工和处理技术的飞速发展，香菇多糖提取工艺得到了很大的改进和提升，香菇被开发出更加广泛的用途。由于运动员长期进行大量的训练，保障运动员肠道的健康尤为重要。结合益生菌改善、治疗肠道疾病的作用，本研究以香菇多糖为原材料，开发了一种香菇多糖益生菌咀嚼片。通过实验证实，有效促进了体育系大学生的肠道蠕动，能够调节肠道免疫功能，改善肠道菌群，促使肠道功能更加健康，有效地避免日常的高强度运动对胃肠道产生的应激刺激，使得肠胃正常生理功能运转受损。