刘 昕，李鹏云，高峻峻，李爱萍，冷茂东，张琳琳，张 展

子痫前期(pre-ecalmpsia，PE)是以高血压、蛋白尿为主要表现的一组妊娠期症候群[1]。研究[2]表明，胎盘发育过程中滋养细胞侵袭能力减弱导致的子宫螺旋动脉重塑不足是PE的主要诱发因素之一。多因素均调节绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblast,EVT)入侵蜕膜和子宫肌层的过程，包括环境因素、细胞因子等。其中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1) 是一类多功能的细胞因子，通过多种机制影响滋养细胞侵袭能力，导致胎盘发育异常，进而参与PE的发病进程。研究[1]显示，TGF-β1抑制滋养细胞侵袭，在避免滋养细胞过度浸润中起到重要作用。

高迁移率族蛋白A1(high mobility group A1，HMGA1)是一种保守的核蛋白，对维持DNA重组、修复及转录有重要作用，在EVT中表达显著。研究[2]表明，TGF-β1在肿瘤细胞中通过调节HMGA1表达，进而调节肿瘤细胞侵袭和迁移。然而TGF-β1通过调节HMGA1进而影响滋养层细胞侵袭尚未见报道。该研究拟进一步探讨TGF-β1 调节人滋养层细胞系HTR-8/SVneo细胞表达HMGA1的相关机制，阐明HMGA1在TGF-β1抑制人滋养层细胞系HTR-8/SVneo细胞侵袭过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂 主要试剂包括重组人TGF-β1(美国PeproTech公司)；P-Akt抗体、HMGA1抗体、Akt抗体(美国CST公司)；β-actin抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；Lipofectamine3000 转染试剂(美国Thermo Fisher公司)；SDS-PAGE试剂(北京康为世纪公司)；Wortmannin(上海碧云天公司)；DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；青霉素、链霉素(美国Sigma公司)。

1.1.2主要实验仪器 主要设备包括Forma-311 CO2培养箱(美国Thermo公司)；Sj-CJ-1800Y超净工作台(苏州安泰公司)；DNM-9606酶标仪(北京普朗公司)；JY-SCZ2+垂直电泳仪(北京君意东方公司)；Bio-Rad 化学发光成像系统(美国赛默飞公司)。

1.2 方法

1.2.1HTR-8/SVneo的培养及传代 用DMEM高糖培养基(10% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)培养HTR-8/SVneo细胞。细胞悬浮后置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱进行培养。用0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d传代1次。实验时，选择对数生长期的HTR-8/SVneo细胞，消化并接种于细胞培养板，接种时每孔细胞浓度为1.0×106，接种后将细胞培养板置于恒温培养箱孵育24 h。

1.2.2TGF-β1作用不同时间对HTR-8/SVneo细胞中HMGA1表达的影响 采用终浓度为5 ng/ml TGF-β1分别作用HTR-8/SVneo细胞0、6、12、24、36 h，收集细胞后提取蛋白和RNA，采用Real-time PCR和Western blot实验检测HMGA1的表达。

Western blot操作步骤如下：用50 μg蛋白按照说明书进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后把蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗脱3次，每次5 min。加入HMGA1、P-Akt、β-actin、Akt的一抗(1 ∶2 000)孵育2 h后 4 ℃过夜。次日TBST冲洗3次，每次5 min，再与二抗(1 ∶5 000)室温作用2 h，TBST冲洗3次，每次5 min，用ECL发光液发光显色，在自动凝胶成像分析系统成像，使用Image J软件进行分析。实验重复3次。

Real-time PCR操作步骤如下：收集细胞后，使用RIPA法提取mRNA,使用 Nanodrop 2000仪器检测总RNA浓度及纯度。根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA 后，根据Real-time PCR说明书，将 PCR 反应孔置于ABI7500型荧光定量PCR反应仪进行反应，记录每个PCR反应孔的CT值(目标扩增产物的荧光信号达到设定阈值所经历的循环数)，按照 2-ΔΔCt方法计算HMGA1和内参β-actin的荧光定量PCR数据。实验重复3次。各引物序列见表1。

表1 Real-time PCR的引物序列

1.2.3TGF-β1通过激活PI3K/AKT通路上调HMGA1 将细胞分为：空白对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1+Wortmannin处理组、Wortmannin处理组。HTR-8/SVneo细胞无血清饥饿12 h后，在TGF-β1+Wortmannin处理组、Wortmannin处理组中加入PI3K/AKT通路抑制剂Wortmannin(0.1 μmol/L)进行预处理1 h，而后用5 ng/ml TGF-β1加入TGF-β1处理组和TGF-β1+Wortmannin处理组，培养24 h后进行蛋白提取，用Western blot检测P-Akt、Akt蛋白表达。

1.2.4阻断PI3K/AKT通路对TGF-β1调节细胞中HMGA1表达的影响 分组同上。依照分组添加或不添加5 ng/ml的TGF-β1和0.1 μmol/L的Wortmannin，采用Western blot法检测HMGA1的表达。

1.2.5HMGA1参与TGF-β1对人滋养层HTR-8/SVneo细胞侵袭的抑制过程 使用验证过沉默效率的HMGA1 siRNA用于后续实验(正义链：GCGAAGUGCCAACACCUAATT；反义链：UUAGGUGUUGGCACUUCGCTT)，根据实验目的，将HTR-8/SVneo细胞分为4组：空白对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1+siHMGA1组、siHMGA1组。采用Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭力的变化。显微镜下随机选取5个视野，观察转移至下室内的细胞并拍照。使用Image J软件分析各组侵袭的细胞数目。

2 结果

2.1 TGF-β1作用不同时间对HMGA1在HTR-8/SVneo中表达的影响为研究TGF-β1对HMGA1表达的影响，用5 ng/ml TGF-β1处理HTR-8/SVneo细胞不同时间。Western blot结果显示，各时间点HMGA1蛋白水平均增高，而处理24 h后HMGA1蛋白水平显著增高(F=1.38，P<0.05)。Real-time PCR显示，5 ng/ml TGF-β1处理24 h后，HMGA1的mRNA水平(3.11±0.08)显著增高(F=19.02，P<0.05)。见图1。

2.2 TGF-β1诱导HMGA1上调通过活化PI3K/AKT通路用TGF-β1浓度为5 ng/ml处理或不处理HTR-8/SVneo细胞24 h，使用Wortmannin(0.1 μmol/L)预处理或不处理1 h，用Western blot检测HTR-8/SVneo细胞PI3K/AKT信号通路的活化情况。结果显示(图2)：与空白对照组比较，在HTR-8/SVneo细胞中TGF-β1明显上调了Akt、P-Akt的蛋白表达水平(F=3.12，P<0.05;F=1.36,P<0.05)。与TGF-β1 组相比，TGF-β1+Wortmannin组中Akt、P-Akt的蛋白表达水平降低(F=1.11,P<0.05；F=1.08,P<0.05)。这说明TGF-β1诱导HMGA1上调通过活化PI3K/AKT信号通路。

图1 不同时间点的TGF-β1诱导 HTR-8/SVneo后HMGA1蛋白和mRNA的表达A：HMGA1 mRNA; B: HMGA1蛋白表达；与0 h比较：*P<0.05

2.3 阻断PI3K/AKT通路对TGF-β1调节细胞HMGA1表达的影响Western blot结果显示(图3)：5 ng/ml的TGF-β1明显提高了HTR-8/SVneo细胞HMGA1的蛋白表达水平(F=5.06,P<0.05)，Wortmannin则抑制了TGF-β1对HMGA1的诱导(F=2.25,P<0.05)。说明通路抑制剂Wortmannin阻断了PI3K/AKT通路，进而抑制了TGF-β1对HMGA1表达的上调作用，即PI3K/AKT信号通路是此过程中的关键环节。

2.4 HMGA1参与TGF-β1对人滋养层HTR-8/SVneo 细胞侵袭抑制过程检查TGF-β1诱导调节HMGA1是否参与TGF-β1对人滋养层细胞的侵袭抑制过程，利用已验证过沉默效率的HMGA1 siRNA转入细胞(Sense：GCGAAGUGCCAACACCUAAT,Antisense：UUAGGUGUUGGCACUUCGCTT)。实验分组如前所述。如图4所示，TGF-β1处理组发生侵袭的细胞数为(45.20±3.38)，空白对照组发生侵袭细胞数为(106.30±3.62)，TGF-β1+siHMGA1组侵袭

图2 Western blot检测TGF-β1和抑制剂Wortmannin单独 及联合作用对HTR-8/SVneo细胞Akt、P-Akt蛋白的影响

A：Akt; B: P-Akt；1：空白对照组；2：TGF-β1 处理组；3：TGF-β1 +Wortmannin处理组；4：Wortmannin处理组；与空白对照组比较：*P<0.05；与TGF-β1处理组比较：#P<0.05

图3 阻断PI3K/AKT通路对TGF-β1 调节细胞HMGA1蛋白表达的影响

1：空白对照组；2：TGF-β1 处理组；3：TGF-β1 +Wortmannin处理组；4：Wortmannin处理组；与空白对照组比较：*P<0.05；与TGF-β1处理组比较：#P<0.05

细胞数为(75.10±2.91)，siHMGA1处理组为(64.60±4.15)。与空白对照组比较，TGF-β1处理组侵袭细胞数明显降低，差异有统计学意义(F=10.51，P<0.05)。与TGF-β1处理组比较，TGF-β1+siHMGA1组侵袭细胞数明显增多，说明HMGA1参与了TGF-β1对人滋养层HTR-8/SVneo细胞侵袭的抑制过程。

图4 各处理组的侵袭细胞数 结晶紫染色×100

A：空白对照组；B：TGF-β1处理组；C：TGF-β1+siHMGA1处理组；D：siHMGA1处理组；与空白对照组比较：*P<0.05；与TGF-β1处理组比较：#P<0.05

3 讨论

PE是一种复杂的全身性血管疾病，增加了怀孕和患严重疾病的风险，极其危害母婴健康[3]。现临床上以对症治疗为主，但终止妊娠才是唯一有效的治疗手段[4]。许多学者认为PE 是一种滋养细胞疾病，因为PE患者胎盘的主要病理特征是滋养细胞浸润过浅和子宫螺旋动脉重塑障碍[5]。而正常妊娠过程中母体子宫内膜是适当浸润的。研究[6]显示滋养细胞侵袭功能的下降与PE密切相关，但相关分子机制尚不明确。

TGF-β是一类多潜能细胞因子超家族，其亚型包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，可以调节细胞分化、增殖、凋亡等重要生物学功能[7]。其中TGF-β1参与滋养细胞的增殖分化，在胚胎着床中起重要作用，可诱导TIMP产生进而抑制滋养细胞浸润[8]。子宫内膜中TGF-β1主要表达于基质和上皮细胞，滋养层细胞也含丰富的TGF-β1。胎盘中TGF-β1定位于绒毛膜滋养层细胞胞质、蜕膜细胞和绒毛附近区域。未着床的孕胚可分泌TGF-β1受体与TGF-β1结合，因此TGF-β1贯穿了整个妊娠过程，包括着床、子宫螺旋动脉重构、胎盘和胎儿的正常生长[9]。研究[10]显示，PE组孕妇母体外周血血清和胎盘组织TGF-β1水平显著高于对照组，可能与PE的发生密切相关。TGF-β1 及其受体通过多种机制引起滋养细胞侵袭不足，影响子宫-胎盘血管床的发育和重塑，导致胎盘缺血低氧，进而参与PE进程。研究[2]表明在甲状腺癌细胞中，HMGA1影响了TGF-β1 在细胞侵袭过程的作用。而在滋养细胞中，HMGA1是否参与TGF-β1对滋养层细胞侵袭的调节仍不清楚。本研究中，TGF-β1通过上调HMGA1抑制滋养细胞侵袭,有助于了解TGF-β1抑制滋养细胞侵袭的作用机制。本研究表明，5 ng/ml TGF-β1明显抑制人滋养层细胞HTR-8/SVneo的侵袭性，这与Cheng et al[1]的研究一致。5 ng/ml的TGF-β1通过PI3K/AKT信号通路对HMGA1表达有上调作用，而加入PI3K/AKT信号通路的抑制剂Wortmanin后，TGF-β1对HMGA1的上调作用明显被抑制，这表明PI3K/AKT信号通路是TGF-β1调节HMGA1表达的桥梁。这与Zu et al[11]在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中的研究有相似之处。

HMGA1是高迁移率族蛋白家族中的一员，它通过与位于多种基因的启动子和增强子区域的A/T丰富DNA序列直接相互作用，参与调控染色质结构[12]。滋养层细胞侵袭不足被认为是PE的发病原因之一，而HMGA1可调节在胎盘形成过程中绒毛外滋养层细胞的迁移，与不充分的滋养细胞入侵有关[13]。而本研究中Transwell实验显示，5 ng/ml的TGF-β1明显抑制了滋养层细胞的侵袭。而用小干扰RNA敲低HMGA1后，减少了TGF-β1对滋养细胞侵袭的抑制作用。这说明HMGA1是TGF-β1抑制滋养细胞侵袭过程的重要环节。然而妊娠中滋养细胞的侵袭与恶性肿瘤的侵袭不同，在时间和空间上受多种因素的综合调节，空间上限于子宫内膜和子宫肌层的内1/3，时间上限于妊娠早期，从而限制了滋养细胞侵袭的深度，所以TGF-β1/HMGA1对滋养细胞侵袭的调节作用与PE的关系仍需进一步探讨。

综上所述，TGF-β1抑制滋养细胞侵袭，可能导致PE的发生。而TGF-β1抑制滋养细胞侵袭通过上调HMGA1表达。为此，推测通过以TGF-β1/HMGA1为靶点，可为探索PE发病机制及为治疗提供新的思路。