王惠国，蔡 珂，，韩鑫龙，，李雨桐，，袁立霞，谭晓梅,4，汤庆发,4，邢学锋,4，陈飞龙,4，吴长清，唐 玲,4

肝癌细胞(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，占原发性肝癌的90%[1]。尽管新型治疗法和诊断技术取得了巨大的成就，但早期发现HCC很困难，导致HCC患者5年生存率较低(0～14%)[1]。因此，发现能够鉴定HCC的特异和敏感的生物标志至关重要。青蒿是一种重要的中草药植物，从青蒿草本植物中提取的青蒿素是抗疟疾药物的有效成分。近年来，已报道了青蒿素的其他功能[2]。最近青蒿素作为抗癌剂由其临床安全性和广泛的功效而受到广泛关注。

在肝细胞癌中，miRNA经常呈现异常的表达谱，这使得其对于诊断或预后应用具有潜在的吸引力。该研究通过RNA-Seq技术，分析在青蒿素药物作用下，肝癌细胞中miRNA表达谱变化，发现与调控肝癌增殖有关的miRNA，为青蒿素在肝癌治疗策略发展中奠定基础。

1 材料与方法

1.1.1实验细胞 肝癌细胞HepG2、Huh7购自美国ATCC细胞库。

1.1.2实验药物 青蒿素购自美国Sigma公司(规格：361593-100 MG)；在二甲基亚砜(DMSO)中制备青蒿素的储备溶液； DMSO的最终浓度保持低于0.01%。

1.1.3实验试剂与器材 DMEM培养基购自美国Gibco公司；RNAiso plus、Premix TaqTM、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)均购自日本TaKaRa公司；AMOAF1000自动细胞计数仪购于美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与实验分组 人肝癌细胞HepG2、Huh7，在含有10% FBS和1%青霉素、1%链霉素的培养液(DMEM培养液)于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。细胞状态良好并生长至对数期时，进行实验处理，每组重复6个孔。

1.2.2Cell Viability Assay法测定细胞增殖 以每孔3 000个细胞，将HepG2和Huh7细胞接种到96孔板，加入完全培养基中并使其附着过夜。第2天加入青蒿素(0、50、100、150、200 μmol/L)处理24、48 h。每个孔中加入20 μl CellTiter-Blue®Luminescent Cell Viability Assay。使用Bio-Rad细胞成像检测仪测量Luminescent的吸光度值。

1.2.3结晶紫实验测定细胞增殖 将HepG2和Huh7细胞接种到12孔板，加入完全培养基中并使其附着过夜(每孔2 000个细胞)。第2天加入青蒿素(0、100 μmol/L)处理7 d。用PBS清洗2遍，每孔加入500 μl的结晶紫溶液，摇床孵育30 min后，PBS清洗3次，每孔加入10%冰醋酸溶液1 ml，摇床孵育10 min后，每孔取等量的溶液入96孔板中，测取550 nm吸光度值。

4.5 通过试验筛选出高效低毒低残留的农药 使用化学农药上要疏堵结合，疏就要给烟农提供可使用的化学农药。通过开展试验筛选出适用于烟叶病虫害防治的高效低毒低残留的农药品种，烟草公司统一采购、统一管理，烟农可以在烟草公司选购到合适的防治农药品种，避免烟农在市场上盲目购买高毒高残留农药，而且有利于管理，对形成以“技术、信息、咨询、物资供应”等一条龙服务打下基础。堵就是要禁止烟农使用高毒、高残留、易超限的农药品种，经检测发现使用者将影响其烟叶被收购等级和来年种植合同签订面积。

1.2.4肝癌细胞总RNA提取、文库构建与测序 收集药物处理24 h的肝癌细胞，细胞进行消化处理，离心后弃上清液加入PBS清洗2遍后，加入1 ml的RNAiso Plus，室温静置5 min，加入200 μl氯仿并振荡混匀，室温静置5 min，离心5 min(10 360 r/min，4 ℃)。将上清液转移至新的离心管中且加入等体积的异丙醇，室温静置10 min，离心10 min(10 360 r/min、4 ℃)。弃上清液，加入1 ml的75%乙醇清洗沉淀，离心5 min(10 360 r/min，4 ℃)。收集沉淀，并自然干燥，溶解于适量的DEPC处理水中。用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，在得到的mRNA中合成cDNA，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。

1.2.5novel miRNA的预测 miRNA前体的标志性发夹结构，能够用来预测新的miRNA。整合miREvo和mirdeep 2这些miRNA预测软件来进行新miRNA的分析，基本原理是通过截取一定长度sRNA比对上的参考序列，通过探寻其二级结构及Dicer酶切位点信息、能量等特征进行分析，预测样品中novel miRNA，并进行各样本中匹配上的sRNA的序列、长度、出现的次数等信息，以及不同长度miRNA的首位点碱基分布和所有miRNA的各位点碱基分布情况的统计。

1.2.6差异表达miRNA和靶基因的鉴定 对各样本中已知和新miRNA进行表达量的统计，并用DEGseq软件进行差异表达分析，在获得差异表达的miRNA中挑选显著性高表达和低表达的miRNA，用miRanda、PITA和RNAhybrid三个软件的交集预测miRNA靶基因。由于每个miRNA鉴定到的靶基因较多，只挑选分值小于-1.2，且能量值小于7的。用火山图可以推断差异miRNA的整体分布情况，从差异倍数(fold change)和校正后的显著水平(padj/qvalue)两个方面进行评估，对差异miRNA进行筛选。横坐标代表miRNA在不同实验组中/不同样品中表达倍数变化，纵坐标代表miRNA表达量变化的统计学显著程度，图中的散点代表各个miRNA，蓝色圆点表示无显著性差异的miRNA，红色圆点表示显著上调的差异miRNA，绿色圆点表示显著下调的差异miRNA。

1.2.7差异miRNA靶基因富集分析 京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集程度通过Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因个数来衡量。其中Rich factor指差异表达的基因中位于该pathway条目的基因数目与所有有注释基因中位于该pathway条目的基因总数的比值。Rich factor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做过多重假设检验校正之后的Pvalue，Qvalue的取值范围为(0，1)，越接近于零，表示富集越显著。

2 结果

2.1 青蒿素对人肝癌细胞HepG2、Huh7增殖的抑制作用Cell Viability实验结果显示，青蒿素对HepG2、Huh7两种肝癌细胞有增殖抑制作用且呈现量效、时间依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。青蒿素对肝癌细胞的增殖有明显的抑制作用，且青蒿素浓度100 μmol/L在24 h时就具有明显的抑制效果，见表1、2。细胞克隆实验结果表明，浓度100 μmol/L青蒿素对人肝癌细胞HepG2的抑制率为(21.93±6.90)%，对Huh7的抑制率为(52.59±3.63)%，有明显的抑制效果且差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。根据实验结果，选择青蒿素药物浓度100 μmol/L，药物作用时间24 h用于后续实验研究。

表1 青蒿素对人肝癌细胞HepG2增殖作用的抑制率

与青蒿素组0 μmol/L比较：*P<0.05；与24 h作用时间点比较：#P<0.05

表2 青蒿素对人肝癌细胞Huh7增殖作用的抑制率

与青蒿素组0 μmol/L比较：*P<0.05；与24 h作用时间点比较：#P<0.05

图1 青蒿素对肝癌细胞克隆形成能力的影响与对照组比较：**P<0.01，****P<0.000 1

2.2 microRNAs 二代测序数据分析

2.2.1Noverl miRNA预测 在HepG2和Huh7两种肝癌细胞中，加入100 μmol/L浓度的青蒿素，作用24 h，其细胞内的miRNA与对照组相比，整合miREvo和mirdeep2这些miRNA预测软件来进行新miRNA的分析，分析得到10种新的miRNA。在二级结构示意中，整个序列是miRNA前体，红色突出部分为Noverl miRNA的成熟体序列。见图2。

2.2.2差异表达miRNA基因的筛选和靶基因的富集分析 在100 μmol/L青蒿素作用24 h后，与对照组相比较。HepG2细胞系中，筛选出上调miRNA基因43条，下调基因41条；Huh7细胞系中，刷选出上调miRNA基因13条，下调基因9条，见图3。在上调和下调的miRNA中，筛选出显著上调和显著下调的miRNA，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。两种细胞系中，相同的差异miRNA有4个，分别是hsa-miR-32-5p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-1307-3p，见图5。

图2 预测Novel miRNA的结构

图3 差异miRNA火山图 A：HepG2;B:Huh7

图4 HepG2和Huh7细胞中显著变化的miRNA

A：HepG2和Huh7细胞中显著上调的miRNA；1：hsa-miR-199a-5p；2：Novel_1144；3：Novel_1213；4：hsa-miR-4426；5：hsa-miR-1273g-3p；6：hsa-miR-451a；7：hsa-miR-556-5p；8：hsa-miR-33a-5p；9：hsa-miR-182-3p；10：hsa-miR-328-3p；B：HepG2和Huh7细胞中显著下调的miRNA；1：hsa-miR-4664-5p；2：hsa-miR-195-3p；3：hsa-miR-1276；4：hsa-miR-3679-5p；5：hsa-miR-4454；6：hsa-miR-10b-3p；7：hsa-miR-4671-5p；8：hsa-miR-1247-3p；9：hsa-miR-1269b；10：hsa-miR-1246

图5 HepG2和Huh7细胞中相同的差异miRNA

在HepG2和Huh7细胞系中，挑选了富集前20位的pathway条目在图6和图7中进行展示。在这些通路中，与HepG2细胞相关的为Rap1信号通路，与Huh7细胞相关的为MAPK信号通路。

图6 HepG2细胞候选靶基因KEGG富集散点图

图7 Huh7细胞候选靶基因KEGG富集散点图

3 讨论

肝细胞肝癌是肝脏最常见的恶性肿瘤之一，是世界死亡率第二的癌症，严重威胁着人们健康[3]。肝癌起病隐匿，早期没有症状或症状不明显，不易被发现，仅40%患者能在早期被发现。但肝癌发生迅速，大多数患者确诊时已经达到局部晚期或发生远处转移，治疗困难，预后很差，严重威胁着人们的健康。肝癌的发生是复杂的过程，外界刺激导致肝细胞遗传性改变，使其增殖、凋亡、结构等发生异常，导致癌症的发生。通过对肝癌发生分子机制的研究，可能为肝癌临床治疗提供新的方法，也是肝癌治疗的理论基础[4]。

miRNA是短小的、非编码RNA，通常由1～22个核苷酸组成。目前已发现超过2 500种人miRNA在各种生理和病理过程中发挥重要作用。例如胚胎发育、细胞增殖、分化、细胞周期进程、细胞凋亡、自噬、血管生成和代谢[4]。最近，已经证明miRNA在人类癌症中表现出组织和疾病特异性模式，表明miRNA可能是用于HCC的早期诊断和预后预测的新型生物标志物[5]。

青蒿是一种使用了2 000多年的传统药物，对疟疾、寄生虫病和纤维化具有显著的疗效，且毒性低[2]。最近几年被报道出具有广泛的抗肿瘤活性，但在肝癌细胞上研究较少。本研究表明青蒿素能够抑制肝癌细胞Huh7和HepG2的增殖，且随着药物浓度增大，抑制作用随之增强；在同一药物浓度下，随着时间的延长抑制作用也越强。说明青蒿素在肝癌细胞中是有一定的研究价值。

本研究利用高通量测序技术对青蒿素作用于两种肝癌细胞Huh7和HepG2 中的miRNA进行测序并分析了差异表达miRNA，其中肝癌细胞Huh7筛选出21个差异表达的miRNA，肝癌细胞HepG2筛选出84个差异表达的miRNA，两种肝癌细胞相同的差异表达miRNA共有4个，分别是miR-32-5p、miR-30e-5p、miR-22-3p和miR-1307-3p，这4个miRNA可能与青蒿素抑制肝癌细胞增殖有密切关系。研究[6]表明，miR-32-5p在肿瘤中异常表达并发挥重要的调节作用，且与膀胱肿瘤的癌症特异性存活密切相关。Chen et al[7]发现，miR-30e-5p与miR-15a一起抑制LRP6的表达并促进GMEC中的脂肪代谢。Chen et al[8]将miR-22-3p鉴定为肿瘤抑制因子，其直接靶向SP1以抑制细胞增殖并诱导HCC中的细胞周期停滞和细胞凋亡。Chen et al[9]发现miR-1307-3p的表达可能被认为是结肠癌患者5-FU化疗疗效的预测因子。

近几年，已经证明miRNA涉及许多类型的疾病，尤其是人类恶性肿瘤。许多miRNA在HCC中失调，这可能对当前的研究有所启发。由于miRNA稳定且易于检测，因此在肝癌组织、血清/血浆和细胞系中报道了它们的异位表达。对于miRNA在肝癌作用机制的研究仍然在不断扩展。本研究通过靶基因预测并进行功能分析，结果显示青蒿素在HepG2细胞中主要调控Rap1信号通路，在Huh7细胞主要调控MAPK信号通路，暗示着青蒿素在不同肝癌细胞中的作用机制各有不同。有研究表明，Rap1的下调能够诱导肝癌细胞HepG2凋亡[10]，且Rap1还可以抑制肝癌细胞的生长和侵袭[11]。MAPK通路联合ERK通路[12]或者RAS通路[13]可以作为肝癌细胞生长的预后标志物。基于大量文献报道，可推测Rap1信号通路和MAPK信号通路在青蒿素抑制肝癌细胞生长过程中发挥了重要的作用。本研究中，大量基因指向多种通路，但具体哪条通路指向青蒿素调控肝癌细胞生长仍需进一步研究。

本研究评估了在青蒿素作用下HCC中失调的miRNA的最新数据，在肝癌细胞Huh7中筛选出21个差异表达的miRNA，在肝癌细胞HepG2中筛选出84个差异表达的miRNA，两种肝癌细胞相同的差异表达miRNA共有4个，并回顾了这些miRNA的报道功能和对靶基因预测进行理论分析，推测它们很有可能适用于青蒿素调控miRNA治疗肝癌的诊断、治疗和预后标志物。