赵亚运，王鑫玲，朱云竹，叶 英

鲍曼不动杆菌(A.baumannii，AB)是引起医院感染的条件致病菌[1]，2017年由中国CHINET细菌耐药数据显示[2]，鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南耐药率在60%以上，替加环素成为治疗的基石药物。近年来的研究表明鲍曼不动杆菌的替加环素耐药与外排泵系统有关，目前与鲍曼不动杆菌相关的外排泵系统共有5个家族，其中ATP结合盒家族的MacAB-tolC[3]和主要易化子超家族的外排泵EmrAB[4]已在其他菌中虽有报道，但在鲍曼不动杆菌中尚未进行详细研究。迫切需要了解不同类型的外排泵基因在临床分离的多重耐药的鲍曼不动杆菌中的分布及表达量与抗菌药物的关系。本研究探讨外排泵基因的表达水平与鲍曼不动杆菌耐药性的关系，尤其与替加环素的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株来源 收集2017年9月份安徽地区10家三甲医院临床科室分离出的多重耐药的鲍曼不动杆菌26株作为实验组，筛选标准为3类或3类以上抗菌药物均耐药，选择野生菌种ATCC17978作为标准菌株，2株诱导菌株由标准菌株分别经过替加环素、亚胺培南诱导产生，分别命名为：17978TGC、17978IMP。所有菌株经过法国梅里埃全自动生物检定仪鉴定。

1.1.2替加环素及亚胺培南诱导耐药菌株选择 ATCC17978菌株替加环素诱导过程如下：接种单个菌落于含有0.5倍的ATCC17978替加环素最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的LB肉汤培养液中，37 ℃，210 r/min，过夜，第2天，取10 μl过夜菌加入含1倍MIC浓度的LB培养液中，37 ℃,210 r/min，过夜，第3天重复前1 d操作，LB培养液含有2倍MIC浓度，连续诱导至64倍MIC为最终诱导浓度，诱导株和原始菌株利用16rRNA、rpoB进行鲍曼不动杆菌菌种鉴定。亚胺培南诱导株及鉴定同上。

1.1.3主要仪器 细菌多点接种仪(英国AQSManufacturing公司)；PCR扩增仪(德国Biometra公司)；核酸电泳仪(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像及分析系统(上海天能公司)；荧光定量PCR仪(LightCycler®96 System,瑞士罗氏公司)。

1.1.4主要试剂 哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南、多粘菌素、庆大霉素、阿米卡星、米诺环素、环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星购自大连美仑生物技术有限公司。替加环素(美国辉瑞公司)；M-H琼脂粉和药敏纸片(英国Oxoid公司)；细菌基因组试剂盒(Tiagen)；RNA提取试剂盒、SYBR Green逆转录PCR试剂盒、PCR Master Mix、DNA marker DL2000均购自日本TaKaRa公司；琼脂糖及染料购自上海生工工程有限公司。

1.1.5引物合成 外排泵基因中的引物设计考文献[5-6]委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1药敏实验 采用M-H琼脂稀释法进行MIC检测，以大肠埃希菌标准菌(ATCC25922)和铜绿假单胞菌(ATCC27853)作为质控菌株，并以2017版美国临床和实验室标准协会(CLSI)[7]的标准判断抗菌药物敏感性。通过肉汤稀释法检测MDR-AB临床分离株对替加环素的敏感性，由于CLSI上无替加环素对不动杆菌的MIC折点解释标准，参照欧洲药敏试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)标准。解释标准为：>2 μg/ml为耐药；≤1 μg/ml为敏感。

1.2.2外排泵基因的检测 按照细菌基因组试剂盒说明提取各株菌的基因组。PCR反应体系及条件：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl， ddH2O 10.5 μl， DNA模板1 μl。以ddH2O为空白对照。第1步，94 ℃预热变性5 min；第2步，95 ℃变性1 min，53 ℃～58 ℃退火复性30 s，72 ℃延伸1 min,进行30个循环；第3步，72 ℃延伸10 min；第4步，4 ℃静止10 min。PCR反应产物取5 μl与0.5 μl 10×上样缓冲液混合，用1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪上观察结果保存。

1.2.3外排泵表型抑制试验 将临床菌株及诱导菌株作为研究对象，采用稀释法，分别加入不同浓度的外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β-苯胺(PAβN)进行筛选，比较菌株加入外排泵抑制剂前后对替加环素及亚胺培南MIC值的变化，其MIC较使用前下降4倍以上，判断为外排泵阳性[8]。

1.2.4RT-PCR检测外排泵基因的表达水平 取上一步筛选出的外排泵基因阳性的菌株进行实验，并以标准菌株ATCC17978为对照组进行实验。

1.2.4.1提取菌株RNA 挑选平板上单个菌落接种于4 ml LB培养基中，37 ℃ 210 r/min过夜，取40 μl的菌液加入4 ml LB培养基中，37 ℃ 210 r/min培养6～8 h，12 000 r/min离心1 min收菌液于无酶的EP管中，按照试剂盒操作说明书步骤提取细菌RNA，最后测其浓度。

1.2.4.2逆转录(冰上操作) 按照试剂盒说明书进行，反应体系如下：5×primescript buffer 4 μl， primescript RT Enzyme Mix I 1 μl， RT primer Mix 1 μl，RNase Free ddH2O和RNA Templet 共14 μl，总反应体系20 μl。逆转录反应条件37 ℃、15 min，85 ℃、5 s， 4 ℃保存。

1.2.4.3荧光定量PCR 取逆转录后的cDNA按照试剂盒说明进行荧光定量PCR，以管家基因rpoB[6]为内参基因，反应条件及体系为：SYBR Premix Ex TaqII 12.5 μl,模板cDNA 2 μl, ddH2O 8.5 μl,总共25 μl。反应步骤为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸50 s，共45个循环。使用Roche Lightcycler®96 System 配套软件分析样本中rpoB和外排泵基因的CT值，以2-ΔΔCt进行耐药菌株间的外排泵基因表达水平进行分析。

2 结果

2.1 药物敏感结果分析26株临床分离的多重耐药的鲍曼不动杆菌体外抗菌活性见表2。从表中可以看出，临床分离的多重耐药的鲍曼不动杆菌对临床常用的头孢类、青霉素类、氨基糖苷类、亚胺培南及美罗培南抗菌药物耐药率超过80%，米诺环素的耐药率46.15%，头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药率46.16%以上，替加环素耐药率11.55%，所有实验菌株对多粘菌素均敏感。其中17978TGC对亚胺培南、美罗培南、多粘菌素敏感，其他抗菌药物都产生不同程度的耐药，17978IMP中除米诺环素、替加环素、多粘菌素都敏感，其他药物都产生了不同程度的耐药。

表2 26株鲍曼不动杆菌对18种抗菌药药敏实验结果[n(%)]

注:在CLSI琼脂稀释和纸片扩散法中以无头孢哌酮钠舒巴坦钠的折点为判断标准，本研究K-B纸片扩散法采用头孢哌酮对铜绿假单胞菌的敏感性判断标准；即S：≥21 mm，I：16～20 mm，R：≤15 mm

2.2 外排泵基因的检测结果26株临床分离株中20株菌均检出了adeB(571 bp)、adeJ(471 bp)、abeM(460 bp)、abeS(148 bp)、macB(540 bp)、emrB(570 bp)、craA(930 bp)，并经过了测序确认，2株诱导菌株全部测出以上外排泵基因，从数据上可以了解到多重耐药的鲍曼不动杆菌中均有外排泵基因分布，其中macB、emrB的检出率在90%以上。部分菌株外排泵基因的PCR产物电泳结果见图1。

2.3 外排泵抑制试验经预实验筛选后，添加PAβN (50 mg/L)后,3株替加环素耐药菌株的MIC值下降了4～8倍,26株碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌中13株的MIC下降了4～16倍以上,2株诱导耐药菌株的MIC下降了16倍。

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图M：DNA Marker；1～5：鲍曼不动杆菌；6：空白对照

2.4 外排泵基因mRNA表达水平和抗菌药物之间的关系本实验所用菌株与标准菌株主动外排泵基因adeB、adeJ、adeS的mRNA表达量具有明显的差异且具有统计学意义(表3)，部分菌株外排泵基因的mRNA表达量差异无统计学意义但表达量高于标准株。由于多重耐药的鲍曼不动杆菌抗菌药物选择压力，替加环素和亚胺培南是临床治疗多重耐药的鲍曼不动杆菌的首选药物，因此选择替加环素和亚胺培南作为分析用来反映外排泵的表达量和抗菌药物的关系，3株替加环素耐药菌株中adeB(P<0.05)、adeJ(P<0.05)、macB(P<0.05)的表达量高于标准菌株(图2)，亚胺培南耐药菌株中adeB(P<0.05)、adeJ(P<0.05)表达明显高于标准菌株(图3)。

表3 多重耐药的鲍曼不动杆菌和诱导耐药菌株外排泵基因mRNA的表达量

17978TGC：替加环素诱导耐药菌株；17978IMP：亚胺培南诱导菌株； 与17978组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

图2 替加环素耐药菌株和敏感菌株外排泵基因的表达量A：adeB基因；B：adeJ基因；C:abeS基因；D:abeM基因；E: macB基因；F：emrB基因；G：CraA基因；与敏感菌株比较：*P<0.05

图3 亚胺培南耐药菌株和敏感菌株外排泵基因的表达量A：adeB基因；B：adeJ基因；C:abeS基因；D:abeM基因；E: macB基因；F：emrB基因；G：CraA基因；与敏感菌株比较：**P<0.01

3 讨论

鲍曼不动杆菌是一种需氧的革兰阴性条件致病菌，广泛存在于医院环境中，由于具有较强的存活力和抵抗力，鲍曼不动杆菌的感染已经成为全球医院需要解决的难题。本实验收集的26株临床分离的多重耐药的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物产生不同程度的耐药，其中碳青霉烯类亚胺培南和美罗培南为100%耐药，头孢菌素类抗菌药物耐药率比较相近，氨基糖苷类抗菌药物阿米卡星耐药率较庆大霉素低，喹诺酮类抗菌药物左氧氟沙星耐药率较环丙沙星低，上述结果证实了多重耐药的鲍曼不动杆菌对多粘菌素和替加环素保持较高的敏感性。2株诱导菌株与标准菌株相比对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物均产生了耐药。本实验收集的菌株均对多粘菌素敏感。鲍曼不动杆菌在亚胺培南、替加环素的作用下可以发展成为多重耐药，并同时对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类等抗菌药物也耐药。

目前在鲍曼不动杆菌中报道的有AdeABC、AdeIJK[9]、AdeFGH[10]、AdeDE[11]、AdeXYZ、AbeM、AbeS等主动外排泵系统。本实验探讨了在鲍曼杆菌ATP结合盒家族MacAB-tolC外排泵基因macB和主要易化子超家族EmrAB外排泵基因emrB，其中macB基因[3]的表达上调和替加环素的耐药有关，Lin et al[4]发现emrB基因敲除的鲍曼不动杆菌比野生株对多粘菌素更敏感。结果显示，外排泵基因adeB、adeJ、abeM、abeS、macB、emrB、craA[12]广泛分布于临床分离株中， 3株临床分离的替加环素耐药菌加入替加环素与PAβN后MIC下降了4～8倍，诱导耐药菌株下降了8倍，表明外排泵在替加环素耐药的鲍曼不动杆菌有一定的作用，在转录水平中macB和adeB、adeJ的表达明显高于标准菌株，替加环素诱导耐药菌株中adeB的表达水平高于耐药菌株。同时验证了Lee et al[13]报道的adeB基因的表达水平可反映外排泵AdeABC基因的过表达是鲍曼不动杆菌对碳青酶烯类耐药的一个机制。本研究尚未发现abeM[14]在亚胺培南耐药菌中的作用，但发现了在多重耐药的鲍曼不动杆菌中adeJ基因高表达。本实验收集的菌株均对多粘菌素敏感，因此emrB基因的表达量相对较低。由于鲍曼不动杆菌耐药机制比较复杂，除外排泵基因外还有产生β-内酰胺酶、外膜蛋白改变、青霉素结合蛋白位点的改变、生物被膜形成、核糖体保护机制[15]等。因此鲍曼不动杆菌的耐药机制仍需要进一步研究。

综上，在抗菌药物大量使用的压力下使细菌固有的主动外排系统表达增强，其质粒、转座子、耐药岛等遗传元件在不同细菌之间广泛的传播，使主动外排泵基因等水平转移，导致多重耐药的鲍曼不动杆菌发生迅速播散，通过主动外排系统的研究可以为临床鲍曼不动杆菌耐药机制提供新的科学依据。由于主动外排泵的机制比较复杂，种类繁多，多个外排泵之间可以相互作用，本文通过分析了多重耐药的鲍曼不动杆菌与外排泵之间的关系，旨在为临床抗菌药物及非抗菌药物的研发提供新的靶点。