许 伶，凌梦玉，陈 超，吕正梅

随着生活方式的改变，高脂饮食、缺少运动等不健康生活方式引起的肥胖相关疾病发病率逐年升高。脂质代谢紊乱是许多原发性和继发性肾脏疾病的共同特征之一[1]。当机体出现脂质代谢紊乱时，会导致肾脏内的脂质沉积，进而进展为肾损伤。国内外围绕脂质代谢紊乱引发的慢性肾损伤的研究越来越多，但对其治病机制仍不十分明确。白藜芦醇(resveratrol，RSV)是多酚类化合物。目前已经证实其具有抗炎、抗氧化的作用，具有保护心脏和脑缺血以及抗肿瘤作用[2]。近年来，研究[3-4]表明其还具有肾脏保护作用。目前研究显示RSV可以通过激动沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1)信号通路发挥保护作用[5]；抑制炎性因子白介素6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)或减少一氧化氮(nitric oxide，NO)释放，减轻肾脏炎性状态[6]。但RSV如何发挥肾脏保护作用的机制尚不明确。该研究探索RSV减轻高脂饮食引起肾损伤的作用及机制具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物造模6周龄雄性C57BL/6J小鼠，SPF级，体质量18～20 g，购自安徽医科大学实验动物中心。将实验小鼠分为3组：正常对照组(control，CTRL组)、高脂组(high lipid，HL组)、RSV干预组(RSV组)。CTRL组：普通饲料喂养；HL组：高脂饲料(1%胆固醇、10%猪油、10%蛋黄粉、20%蔗糖、59%维持料)喂养；RSV组：高脂饲料同HL组，并以RSV 5 mg/(kg·d) 灌胃，RSV购自南京泽朗植提技术有限公司，每周称量小鼠体质量，根据体质量调整RSV用量。

1.2 血脂检测18周后实验结束，摘除小鼠眼球收集血液，取血清测血脂(日本OLYMPUS AU640全自动生化分析仪)、肾功能。

1.3 肾组织学观察各组肾组织制作5 μm厚石蜡切片，常规HE染色、PAS染色，在普通光学显微镜下观察肾脏组织病理变化。

1.4 免疫组织化学染色取各组肾组织石蜡切片，常规脱蜡至水，枸橼酸盐修复，3% H2O2孵育阻断内源性过氧化物酶(武汉博士德生物工程有限公司)，正常山羊血清封闭；加抗纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)抗体(1 ∶200)(美国proteintech公司)，4 ℃ 孵育过夜；羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)工作液37 ℃ 孵育1 h；SP工作液(北京中杉金桥生物技术有限公司)37 ℃孵育30 min；DAB显色(北京中杉金桥生物技术有限公司)，脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作阴性对照。

1.5 Western blot取约50 mg肾组织，加入RIPA裂解液(含PMSF，100 ∶1)充分匀浆，BCA法定量测定蛋白浓度。等量蛋白上样后12%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后恒流转至PVDF膜，室温5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)(1∶1 000)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)(1∶1 000)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)(1∶1 000)、SITR1(1∶1 000)均购自美国CST公司，GAPDH抗体(美国Proteintech公司)4 ℃ 孵育过夜，洗膜后37 ℃ 二抗(1∶10 000)孵育1 h；TBST洗膜后，现配显影液，上海培清科技有限公司ECL曝光机曝光，保存图片。实验结果用Gel-ProAnalyzer软件进行分析。

1.6 RT-PCR取肾脏组织约50 mg，TRIzol(大连宝生生物工程有限公司)匀浆后酚-氯仿法提取总RNA。用TaKaRa公司5×PrimeScript RT Master Mix进行逆转录反应。TaKaRa公司Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)进行cDNA样品扩增，琼脂糖凝胶电泳，上海培清科技有限公司凝胶成像仪拍照，凝胶成像系统SensiAnsy分析处理。引物序列见表1。

表1 RT-PCR的引物序列

2 结果

2.1 3组体质量、血脂和肾功能比较HL组与CTRL组相比，体质量增加(P<0.05)，高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)下降，低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)增高(P<0.05)，总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)和尿酸(uric acid，UA)水平增高(P<0.05)；RSV组与HL组相比，血脂水平HDL-C升高，LDL-C下降，TC、TG和UA水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)。血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)差异无统计学意义。见表2。

表2 各组小鼠体质量、血脂、肾功能比较

与CTRL组比较：*P<0.05；与HL组比较：#P<0.05

2.2 3组肾脏组织学变化HE染色显示CTRL组小鼠肾组织结构基本正常。HL组小鼠肾小球系膜细胞和基质稍增多，偶见节段性肾小球硬化，肾小管间质纤维化，可见间质细胞增多，炎症细胞浸润；肾小管上皮细胞淡染，胞质增多。RSV组肾小球面积略有缩小，系膜增生明显减轻。表明RSV可以改善高脂饮食诱导的慢性肾脏损伤，见图1。PAS染色显示正常组小鼠肾组织结构基本正常，少量红染，高脂组小鼠肾小球糖原沉积增多见明显红染区，RSV组肾小球红染明显变淡，见图2。

图1 各组肾脏组织病理改变 ×200A：CTRL 组；B：HL组；C：RSV组

图2 各组肾脏组织PAS染色改变 ×400A：CTRL 组；B：HL组；C：RSV组

图3 各组肾脏组织FN表达免疫组化染色 ×400A：CTRL组；B：HL组；C：RSV组

图4 Western blot法检测各组肾组织GRP78、GPx4、SOD2、SIRT1蛋白水平与CTRL组比较：*P<0.05；与HL组比较：#P<0.05

2.3 3组小鼠肾组织FN的表达免疫组化结果显示FN主要在肾小体细胞间质表达，CTRL组和RSV组小鼠肾组织呈弱阳性表达，HL组表达增加，阳性染色呈棕黄色。见图3。

2.4 3组小鼠肾组织GRP78、GPx4、SOD2和SIRT1蛋白表达与CTRL组比较，HL组肾组织抗氧化相关蛋白GPx4、SOD2、SIRT1表达水平明显下调(P<0.05)，内质网应激分子标志物GRP78的蛋白表达上调；与HL组比较，RSV组抗氧化相关蛋白GPx4、SOD2、SIRT1的表达上调，内质网应激分子标志物GRP78蛋白的表达下调(P<0.05)。见图4。

2.5 3组肾脏组织中GRP78和CHOP mRNA表达与CTRL组比较，HL组肾组织GRP78和CCAAT增强子结合蛋白的同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein-homologous protein，CHOP)mRNA表达明显上调(P<0.05)；而与HL组比较，RSV组肾组织GRP78和CHOP mRNA表达水平均明显下调(P<0.05)。见图5。

图5 RT-PCR法检测各组肾组织GRP78和CHOP mRNA 水平

M：Marker；与 CTRL组比较：*P<0.05；与HL组比较：#P<0.05

3 讨论

肥胖对健康的影响日益严重，在发展中国家也变得越来越普遍。近年来，较多的研究[7]表明肥胖与肾功能障碍之间有密切的关系。目前研究[8]显示，脂质代谢紊乱是慢性肾脏病进展的危险因素。本实验结果显示，经过18周的高脂饲料喂养后，HL组小鼠的体质量明显高于CTRL组；血清中TC、TG和UA水平高于CTRL组；HL组小鼠HE染色、PAS染色和FN免疫组化结果证实，肾组织存在损伤性改变。提示高脂饮食可诱导小鼠的脂质代谢紊乱，可能通过多种途径，对肾小球内皮细胞、系膜细胞造成损伤，引起系膜增生，细胞外基质增厚，糖原沉积，肾小球硬化和间质纤维化，进而损伤其肾功能。有临床研究[9]显示慢性肾功能障碍和血脂异常进展之间的密切关系。研究[10]表明，高三酰甘油血症可促进LDL沉积并降低HDL水平，增加慢性肾病进展风险。

虽然脂质介导的肾损伤初始机制尚不清楚，但目前认为氧化应激、内质网应激以及炎症反应是参与脂质介导肾损伤的主要机制[11]。研究[12]表明高脂血症能增加单核细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成速率，它是一种内皮损伤的重要因子，随着ROS生成增多，触发氧化应激反应，致使内皮细胞损伤严重，这可能是脂质诱导肾损伤的重要机制。哺乳动物在呼吸和新陈代谢过程中产生的很多ROS由体内的自由基清除剂和抗氧化酶进行清除。抗氧化剂SOD2是重要的超氧化物歧化酶；GPx4是催化氧化氢转化为水的另外一种抗氧化物酶。SIRT1是一种NAD+依赖的蛋白去乙酰基酶，可调节细胞内的代谢，诱导ROS的凋亡，抑制氧化应激。研究[13]已经证实SIRT1在肾损伤中的重要作用，无论是糖尿病肾病、急性肾损伤激活SIRT1都能够抑制肾损伤的进展。本实验研究也表明，与CTRL组比较，HL组肾组织SIRT1、SOD2和GPx4蛋白表达明显下调；与HL组比较，RSV组能够上调肾组织GPx4和SOD2蛋白的表达，RSV作为SIRT1的激动剂，则使SIRT1蛋白表达明显上调。

氧化应激虽然目前被认为是多种疾病致病的重要环节，而任何干扰氧化还原的调控都能够导致内质网应激，有研究[14]指出内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可通过未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)以及与线粒体之间的相互作用产生过多的ROS，诱导局部组织和细胞的氧化应激(oxidative stress，OS)。GRP78和CHOP是内质网应激和UPR激活的标志，CHOP是促凋亡UPR的反应基因，在内质网应激参与急性肾小管坏死和急性肾损伤机制中发挥重要作用。本实验发现，与CTRL组比较，HL组肾组织CHOP和GRP78 mRNA水平表达上调，以及GRP78的蛋白表达也明显上调。而与HL组比较，RSV组显著下调肾组织CHOP和GRP78 mRNA的表达水平，下调GRP78的蛋白表达。

研究[6]显示，RSV具有较强的清除自由基和抗脂质过氧化功能，可控制高热量饮食引起的动物体质量增加，增强脂蛋白的抗氧化能力，改善血管内皮功能，降低LDL、TC水平。因此RSV可能通过调节脂质代谢紊乱清除过多的ROS和改善与高脂相关的OS、ERS；改善肾脏上皮细胞线粒体结构和功能的损伤，从而发挥对肾脏的保护作用。

本课题阐明了长期高脂饮食导致的肾组织损伤和肾功能下降的分子机制及RSV通过减轻肾组织氧化应激和内质网应激等机制发挥保护作用机制，为慢性肾损伤治疗方法提供了新的思路。